盐酸戊乙奎醚对大鼠双下肢缺血再灌注后心肌细胞凋亡的影响(2)
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1.3 肢体缺血再灌注模型动物的制备
大鼠术前12 h禁食，自由饮水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔内注射麻醉，4 h后追加1/2量。双侧股三角处切开皮肤，分离出股动脉，用无创微动脉夹于近腹股沟韧带处夹闭股动脉，使双下肢缺血，缝合创口。以扪不到足背动脉搏动、双足变暗变凉为缺血成功的标志。4 h后打开原切口，去除动脉夹恢复双下肢血流，再灌注4 h，动脉搏动恢复，双足逐渐变红变暖，为建模成功。
1.4 实验分组及处理
实验大鼠随机分为三组，分组各20只。①缺血再灌注组(H组)：再灌注前30 min 腹腔注射2 ml生理盐水；②盐酸戊乙奎醚组(M组)：再灌注前30 min腹腔注射盐酸戊乙奎醚2 mg/kg(用生理盐水稀释至2 ml)；③对照组(C组)：行假手术处理，无缺血再灌注，余手术麻醉步骤同①②。
1.5 标本采集及处理
三组随机各取10只观察24 h存活率，余M组和H组均在再灌注4 h后在麻醉状态下腹主动脉放血活杀动物，C组麻醉后同法活杀。迅速开胸取心肌，心尖部取HE染色标本，余心肌-80℃超低温冰箱冻存，待以后批量检测MDA、SOD、MPO、IL-10、TNF-α。
1.6 观察指标及方法
快速用刀片将心尖部组织切下，生理盐水冲洗干净后投入10%甲醛固定24 h行HE组织染色。余心肌复温后制成冷的心肌组织匀浆，分别用紫外分光光度计检测SOD (黄嘌呤氧化酶法) 、MDA (硫代巴比妥酸法)、MPO(髓过氧化物酶)、心肌组织蛋白(考马斯亮兰法)吸光度后再进行计算SOD活力、MDA含量，酶标仪检测IL-10和TNF-α(ELISΑ法)，严格按各试剂盒说明书操作。
1.6.1 Bax和Bcl-2蛋白表达测定 10%甲醛固定，石蜡包埋切片，采用免疫组化染色法显色。检测方法严格按说明书操作。光镜下观察，阳性反应为细胞浆呈棕黄色染色，不染色者为阴性。在高倍镜(×400)下，拍摄组织切片图像。每片随机计数5个视野，每个视野计数Bcl-2、Bax蛋白阳性表达细胞，以阳性细胞核数占细胞核总数的百分比为Bcl-2、Bax蛋白阳性表达指数(PEI)。
1.6.2 细胞凋亡检测 采用原位缺口末端标记法(TUNEL)，检测方法严格按说明书操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。计算5个高倍视野下(×400)的凋亡细胞数，以凋亡细胞个/100细胞表示凋亡指数(apotosis index，AI)。
1.6.3 组织病理学检查 10%甲醛中固定心肌组织，石蜡包埋切片，染色后光镜下观察。
1.7 统计学方法
使用SPSS 13.0统计软件，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析；相关分析采用Pearson相关分析法；定性资料采用卡方检验；P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌组织形态学变化
C组心肌细胞大小、形态均正常。H组可见心肌组织水肿、炎性细胞浸润、局灶性出血等，而M组心肌组织病理改变均较H组有所减轻。
2.2 心肌组织MDA、SOD、MPO、TNF-α和IL-10、AI水平
再灌注后，即H组较C组心肌组织MDA、MPO、TNF-α和IL-10水平、Bax表达、AI均明显升高(P<0.05)，而SOD活性、24 h生存率降低(P<0.05)；使用盐酸戊乙奎醚后，即M组较H组SOD活性、IL-10含量、24 h生存率均升高(P<0.05)，MDA、MPO、TNF-α含量、Bax表达、AI均明显降低(P<0.05)。见表1~2。
2.3 相关性分析结果
MDA与Bax显著正相关(相关系数r=0.483，P<0.05)MDA与AI之间显著正相关(相关系数r=0.738，P<0.01)。
3 讨论
近年实验证实，急性肢体缺血再灌流后不但损伤肢体本身，还可诱导产生全身炎症综合征(SIRS)，造成远隔器官(肝、肺、脑、肾、心等)损伤，中性粒细胞及活性氧物质所引起的炎症和氧化应激性损伤可能是其发生的主要因素[4]。
IL-10在炎症反应中主要发挥抗炎因子的作用。MPO可定量表达中性粒细胞(PMN)的聚集程度，两者的表达平衡可反映心肌局部炎症反应和中性粒细胞聚集的程度。体内氧自由基主要由黄嘌呤氧化酶及中性粒细胞、巨噬细胞呼吸爆发产生，局部炎症反应可导致氧自由基大量产生，使细胞膜脂质过氧化、DNA破坏等损伤，诱导细胞凋亡。由于氧自由基具有极强的反应活泼性，半衰期短，难以捕捉，常通过体内氧化-抗氧化系统间接反映体内氧自由基的产生情况，SOD是清除O2-的专一歧化酶，反映了体内抗氧自由基能力。MDA反映了机体脂质过氧化程度，间接反映组织内自由基水平[5]。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，而Bax促进凋亡。Bcl-2与Bax表达平衡与细胞凋亡途径紧密相关。Bxl-2表达下调和(或)Bax上调都显示细胞凋亡增加。本研究显示，双下肢IR后IL-10和MPO明显升高，MDA大量产生，SOD活性明显下降，Bcl-2无显著变化，Bax蛋白阳性表达指数增加，Bax/ Bcl-2比例升高，而使用盐酸戊乙奎醚IL-10进一步升高，MPO下降，SOD活性明显上升，MDA产生减少，Bax/ Bcl-2比例下降；相关性分析结果显示MDA分别与Bax和AI显著相关。表明双下肢IR心肌中性粒细胞聚集，局部炎症反应增强，抗氧化机制受到破坏；大量氧自由基释放，诱导Bax促凋亡因子释放，导致心肌细胞凋亡；盐酸戊乙奎醚通过抑制心肌局部炎症反应，使自由基生成减少，从而抑制Bax促凋亡因子产生，最后减少AI，这可能与抗胆碱药能稳定溶酶体和线粒体等亚细胞结构，减少溶酶体酶的释放，抑制花生四烯酸代谢物的产生和休克因子的形成，达到细胞保护作用有关[6]。
TNF-α是单核/巨噬细胞和其他促炎细胞激活后释放的细胞因子， 水平升高比其他细胞因子更快，为最早的重要内源性介质之一，TNF-α与TNFRⅠ受体结合后激活caspases导致细胞凋亡。本实验结果表明：肢体缺血-再灌注后，心肌组织匀浆中TNF-α较对照组明显增高，在一定程度上反映TNF-α在肢体缺血-再灌注心肌损伤过程所起的重要作用，而盐酸戊乙奎醚组显著下降提示盐酸戊乙奎醚降低心肌TNF-α的浓度，在抑制TNF-α诱导心肌细胞凋亡方面有现实的临床意义。
总之，肢体缺血IR激活PMNs 及其他炎性细胞，产生大量氧自由基及炎性介质，使机体处于一种无法控制的过度炎症反应状态，引起心肌损伤，心肌细胞凋亡。本实验表明，盐酸戊乙奎醚能够有效减轻肢体缺血再灌注损伤后引起心肌损伤，清除心肌氧自由基，提高机体抗氧化能力，减轻心肌炎症反应，减少TNF-α等凋亡诱导因子产生，从而从内外源两条途径发挥抗凋亡作用。可能机制为选择性抗胆碱作用而不增加心率，有利于减少心肌氧耗，减轻肢体IR心肌损伤；改善微循环，拮抗炎症因子及炎症介质，保护细胞膜及溶酶体膜，降低毛细血管通透性等，可减轻局部炎症反应，缓解心肌细胞氧化应激反应发挥作用。
[参考文献]
[1] 林大伟,菅向东 ......
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