固本补肾汤对前列腺基质细胞增殖的影响(2)
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1.2 方法
1.2.1 前列腺基质细胞原代、传代培养及纯化、鉴定 在超净台上将前列腺组织剪为约1 mm3大小，采用组织块贴块法进行接种，参照文献[2-3]进行原代及传代培养(基质细胞培养液中加入雌二醇作为促增生剂)，采用自然纯化法、机械化除法、差速贴壁法纯化基质细胞。培养3～4代后基本上可得到纯化的基质细胞，采用RT-PCR法检测平滑肌分化特异性蛋白smoothelin的表达(smoothelin片段：上游引物5-GGTCGAAGATGCTGCCCATCTT-3′、下游引物5′-TCCGACAAAGGAAGAGAGACC-3′、片段长度为324 bp；同时以β2微球蛋白引物扩增片段作为内参标：上游引物5′-AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT-3′、下游引物5′-ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT-3′、片段长度为285 bp)，检测结果基质细胞纯度达98%。
1.2.2 实验药物细胞毒性实验 将制备的固本补肾汤溶液用DMEM培养液以几何比稀释，对基质细胞培养24 h后，观察细胞情况，并根据光密度(optic density，OD)值计算药物对细胞的毒性作用[公式为：(药物组平均OD-空白组平均OD)/空白组平均OD×100%]，取毒性作用<15%的浓度作为观察浓度。按细胞毒性实验结果，设实验药物高(10 ng/ml)、中(1 ng/ml)、低剂量组(0.1 ng/ml)，他莫昔芬组，并设模型对照组及空白对照组，进行干预培养，每组重复5瓶。
1.2.3 MTT法检测固本补肾汤对前列腺基质细胞的增殖作用影响 取第4代细胞悬液以4×104/ml浓度接种于96孔板，每孔500 μl，培养24 h使细胞贴壁，用Hank's液冲洗2次。换成含0.5%进口马血清的DMEM培养液24 h后，同时每孔加入含药细胞培养液，每孔加500 μl，每浓度4个复孔，设他莫昔芬对照组5个，并设模型对照组5个，不含药物，而加入等量的培养液(含雌二醇)，另设空白对照组5个(培养液中不含雌二醇)，在37℃，5% CO2恒温箱中放置24 h，在每孔中加5 mg/ml MTT 20 μl，同样条件下培养4 h，终止培养，吸取孔内培养液，每孔加入100 μl的二甲基亚砜，室温下震荡5 min，使结晶物充分溶解，在590 nm处测OD值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0软件统计分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验。
2 结果
在24 h 时，他莫昔芬组及固本补肾汤各剂量组对细胞生长有都明显的抑制作用，与模型组比较，差异有高度统计学意义(P<0.01)；固本补肾汤各剂量组之间比较，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)；低剂量组与他莫昔芬组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组与他莫昔芬组比较，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)。见表1。
3 讨论
BPH是由于前列腺上皮或基质细胞增生，引起的一系列下尿路梗阻症状，但BPH患者的临床症状并不与增生的前列腺腺体大小成正比[4]组织学的研究提示了前列腺基质成分在BPH发病中的重要性[5]。历代医家多将其归属于中医“癃闭”的范畴。现行的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》正式将其定名为“精癃”，病位在膀胱与精室。
《景岳全书·积聚》云：“凡脾肾不足及气弱失调之人，多有积聚之病。”本病多由于年老体弱，或因年老阴阳气衰而致脾虚，气化无力，日久痰浊瘀血留滞而成，属本虚标实。刘猷枋教授也提出肾气虚、气化不利和瘀血内阻是BPH发生的最重要因素[6]。固本补肾汤方中黄芪、党参益气利水，大补脾气而达到气化得行，则小便自通的目的；丹参、当归活血化瘀，破宿血、补新血；王不留行活血通络、利尿通淋；枸杞子、肉苁蓉以补肾化气。全方以益气活血为主，辅以补肾之品，以达到补肾化气、活血散结的作用。
本次研究通过MTT法检测了固本补肾汤对体外培养人前列腺基质细胞增殖的影响，结果表明固本补肾汤能抑制体外培养前列腺基质细胞的增殖，这可能是固本补肾汤治疗良性前列腺增生症的作用机制。
[参考文献]
[1] 刘本臣.中医药治疗良性前列腺增生症的研究进展[J].甘肃中医,2007, 20(12):68-70 ......
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