聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染色检测方法的改进及其效果比较(1)
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[摘要] 目的：探索快速、经济的银染色方法。方法：本研究对前人文献所报道的一种银染检测方法的检测步骤和试剂用量进行了优化，省略了操作过程中的固定步骤，简化了停显液的组成成分。结果：优化后的方法在配制试剂时只需3种化学试剂，染色液中硝酸银的用量被减少至1.0 g/L，显影液中氢氧化钠的浓度被降低至10 g/L，DNA检测效果表明优化前后的两种检测方法的检测灵敏度均可达5 ng左右。结论：优化后的DNA银染色检测方法更加经济、快速。
[关键词] 银染；聚丙烯酰胺凝胶；DNA
[中图分类号] R446.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2011)07(a)-020-03
Optimization of a silver staining method for detecting DNA in polyacrylamide gels and comparison of its effect on test
FAN Jing
College of Chemistry and Life Science, Leshan Normal University, Sichuan Province, Leshan 614004, China
[Abstract] Objective: To establish a cheaper and faster silver staining method. Methods: One silver staining method reported by other researchers had been modified in the steps and reagent dosages, in which, the fixation step had been omitted, the composition of stop solution was simplified. Results: Only three kinds of chemical reagents were required for detecting solutions, the dosage of sivler nitrate in staining solution and sodium hydroxide in developing solution were reduced to 1.0 g/L and 10 g/L respectively. The limit of DNA detection upon visual observation for both of the two methods was approximately 5 ng. Conclusion: The optimized silver staining method is much cheaper and faster.
[Key words] Silver staining; Polyacrylamide gels; DNA
银染检测技术由于操作简单、检测结果易于观察而被广泛应用于分子标记研究的聚丙烯酰胺凝胶内DNA的检测[1-3]。关于DNA银染检测技术的优化在过去已有一些报道[4-9]，为了进一步节省实验操作时间和实验成本，本研究对前人所建立的一种聚丙烯酰胺凝胶中DNA银染检测方法进行了优化，省略了其中的用固定液对凝胶中DNA进行固定的步骤，降低了染色液中硝酸银和显影液中氢氧化钠的浓度，简化了停显液的试剂组成成分，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料
人体血液由乐山师范学院学生志愿者提供，为防止血液凝固，将1.2 ml血液装入含有0.3 ml浓度为109 mM/L的枸橼酸钠溶液的Eppendorf管中，混匀后放置于-20℃冰箱中保存，PCR扩增引物根据NCBI数据库中人类短串联重复序列微卫星D18S51基因座序列(GenBank登录号：L18333)，使用引物设计软件Primer Premier 5设计，上游引物为5'-TGAGGCAGGAGGAGTTCTTG-3'，下游引物为5'-ATGTTGGCTTCTCTCTGTTCT-3'，DNA分子量标记DL2000 购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 D18S51基因扩增 基因组DNA参照文献用碘化钾方法提取[9]，D18S51基因座的扩增体系为25 μl，各反应成分的终浓度为1.0×PCR buffer，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L 每种dNTP，引物浓度为0.4 μmol/L，1 μl基因组DNA(约27 ng)，Taq DNA聚合酶1.0 U，PCR扩增条件为：95℃预变性4 min，随后94℃变性50 s，58℃退火35 s，72℃延伸35 s，共30个循环，最后72℃保温10 min。
1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测 聚丙烯酰胺凝胶浓度约为7%，厚度为1.0 mm，由14.67 ml蒸馏水、23.33 ml 12%聚丙烯酰胺凝胶母液、2 ml 10×TBE配制而成，电泳缓冲液为0.5×TBE，分别将DNA marker DL2000和D18S51基因座PCR扩增产物上样至聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，电泳时电压为250 V，时间约为2.5 h，电泳结束后，揭开玻璃板的短板，将聚丙烯酰胺凝胶依次放入各种检测溶液中处理，具体参照表1。
2 结果
2.1 显影液中氢氧化钠剂量的优化
在配制检测溶液所需的所有试剂中，氢氧化钠的用量是最大的，为了有效降低实验成本，摸索检测溶液中氢氧化钠的较低用量，本实验选取氢氧化钠作为单因素影响因子，其他试剂的成分和用量同表1中优化后的方法，研究了显影液中添加不同浓度的氢氧化钠对DNA检测效果的影响，结果表明当氢氧化钠的浓度为10、20、30 g/L时，均能得到具有清晰凝胶背景的深黑色DNA条带，当氢氧化钠的浓度为5 g/L时 ......
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