62例翼状胬肉切除术后角巩膜缘重建患者病理分析(2)
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1.2 印迹细胞学检查方法
准备醋酸纤维素滤纸、培养皿和组化试剂，滤纸裁成4 mm×3 mm半梯形，用无齿镊将毛面向下放于眼表，贴紧后揭下，滤纸固定于96%酒精中10 min以上。蒸馏水化、过碘酸氧化后漂洗5 min，分别行席夫染色和苏木精染色，分别用70%、96%、100%酒精脱水2次，每次2 min。浸泡50%二甲苯和50%酒精中5 min，最后二甲苯脱水15 min，树脂固定。
1.3 BUT检查方法
在下睑结膜囊内滴2~3 μl 1%荧光素钠，自行眨眼数次，用裂隙灯显微钴蓝色光观察计算从泪膜形成到第一个干斑出现时间。重复测量3次后取平均值。
1.4 指标评价标准
杯状细胞计数根据一张玻片上任意10个区域之和乘每平方毫米上杯状细胞的数量取平均值而得。鳞状上皮化生分级依据：①杯状细胞密度及黏液黏度；②非分泌上皮细胞形态；③细胞浆着色；④细胞间距离；⑤细胞核形态；⑥上皮细胞核/浆比；⑦角质化与否。等级划分根据Nelson标准[1]。BUT<10 s为异常。
1.5 统计学处理
所有数据经SPSS 13.0软件处理，健、患侧指标对比指标比较均用配对t检验，等级资料比较用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 眼表各位点杯状细胞健患侧计数比较
62例患者角巩膜缘重建后眼表上球结膜、睑间结膜、下球结膜、下睑结膜处的杯状细胞计数健患侧眼比较，数据[(5.0±3.4)、(1.7±0.6)、(-1.2±0.4)、(4.9±1.3)]差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表162例患者眼表各位点杯状细胞健、患侧比较(x±s，个)
注：差值平均值与0比较，*P>0.05
2.2 治疗前后眼表鳞状上皮化生分级比较
治疗前后患者眼表鳞状上皮化生分级治疗后秩和大于治疗前，总体分级降低(Hd=18.3)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表262例患者治疗前后眼表鳞状上皮化生分级(例)
2.3 患眼与健眼泪膜破裂时间比较
每位患者患眼与健眼泪膜破裂时间(BUT)比较，患眼均值为(12.3±2.1)s，健眼为(12.6±2.2)s，平均差值(0.3±0.1)s，差异无统计学意义(P>0.05)。所有患眼未见双核、固缩细胞，3例出现下球结膜少量炎症细胞，2例出现下睑结膜少量炎症细胞。总炎症细胞出现率约为8%。
3讨论
3.1翼状胬肉病理学研究及诊治概述
目前普遍认为，翼状胬肉是环境因素和遗传因素共同作用的结果。有约1/3患者有家族史，生活在同一地区不同人种发病可有较大差别[2]。日照量大者发病率较高，推测紫外线为最主要的环境因素，此外还有风沙、粉尘等因素可能起作用。近年来多数研究认为角膜缘干细胞功能障碍是翼状胬肉发病基础。第一阶段，在日光、风沙等致病因素作用下，角膜缘干细胞受损致角结膜屏障功能障碍。第二阶段，细胞明显增生，并且发生炎症、血管化及结缔组织变形，角膜组织向结膜组织转化，发生翼状胬肉。在组织学上，翼状胬肉既有增生又有变性[3]。光镜下可以看见角膜缘上皮和球结膜下存在无定形、嗜伊红染色的玻璃样变性或颗粒状变性物质。同时可伴有变性胶原组织间散在断裂、卷曲、碎片状弹力纤维。超微电镜下，上皮下上述结构为变性胶原纤维及基质退变后产物。
目前非手术治疗一般为抗代谢药、抗炎药或抗肿瘤药物，辅以人工泪液等对症处理。手术治疗是首选治疗方式。单纯手术切除复发率高达45%左右，故常辅以结膜移植、角膜干细胞移植、羊膜移植以减少复发率[4-6]。笔者选取对象均为手术切除后辅以自体角巩膜缘重建术患者，是目前效果明显且复发率较低的术式。
3.2印迹细胞学研究眼表疾病特点
印迹细胞学是应用醋酸纤维素滤纸粘取眼表细胞，经染色后研究细胞形态结构、细胞间连接及其他细胞成分(炎细胞等)、鳞状上皮化生程度和杯状细胞情况，从而诊断眼表疾病的技术。可同时行光镜、电镜、免疫组化分析研究，故常代替组织活检了解眼表情况，有简单、快速、可重复、无损害等优点[7]。其主要目的包括：①了解眼表上皮情况。②用PAS染色分泌细胞如杯状细胞。③观察眼表黏膜颗粒、黏液丝、炎细胞、细胞碎片等。④通过巴帕克拉乌染色显示清晰细胞浆、浓缩的染色体、上皮的分化状态。本研究基于印迹细胞学技术的上述优点，选取其为研究方式，力图借助其高敏感性和高特异度作出准确判断。
3.3 翼状胬肉角巩膜缘重建后病理分析
翼状胬肉切除术后进行自体角巩膜缘重建的主要目的在于以自体眼为供体取代已损伤的角膜缘，通过移植后干细胞的增殖、进一步分化和细胞的向心性移行，阻止新生血管侵入，达到修复、稳定受损伤角膜表面的目的。杯状细胞是眼表的主要分泌细胞，其分布在眼表各个部分疏密有所不同，杯状细胞的数量和功能决定了眼表的泪液分泌功能和泪液的黏蛋白含量，进一步决定了泪膜的稳定性，而数量作用更为重要。本研究中，患眼术后杯状细胞在各个位点上与健侧眼差异均无统计学意义(P>0.05)，说明重建后泪液分泌在数量和质量上均得到较好恢复，患眼术后泪膜破裂时间(BUT)均值在10 s以上，与健侧比较差异也无统计学意义(P>0.05)，进一步表明术后泪液分泌功能得到良好重建。另外，翼状胬肉患者存在不同程度的鳞状上皮化生，此为翼状胬肉细胞分化、异常增生的重要表现，因此术后效果观察重要一环即是术后鳞状上皮化生情况，化生停止或完全停止，被正常的增殖过程取代是判断重建效果和预测复发的重要方面。本研究发现，自体角巩膜缘重建后，鳞状上皮化生总体较治疗前等级下降(P<0.05)，显示治疗有效地阻止异常化生进程并为重新恢复正常的细胞增殖凋亡提供了契机。此外，<10%患者仍出现术后眼表少量炎症细胞浸润，可能与患眼免疫反应有关，提示术后有必要抗炎治疗，值得临床重视。
综上所述，病理分析显示，翼状胬肉术后角巩膜缘重建患者能够良好恢复泪液分泌的数量和质量，鳞状上皮化生可停止甚至可以恢复正常的细胞增殖凋亡，值得进一步研究探讨[8]。
[参考文献]
[1]刘祖国,王智崇,陈家祺,等.眼表疾病学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2006:9.
[2]刘旭阳,张清炯,蔡素萍,等.眼病的细胞和分子生物学基础[M].北京:科学出版社,2010:4.
[3]王雨生,王海英,严密,等.脉络膜新生血管性疾病[M].北京:人民卫生出版社,2007:12 ......
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