山核桃树叶中球松素查耳酮的含量测定(2)
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2.2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(65∶35，V/V)，流速为1.0 ml/min，检测波长为342 nm，柱温为30℃，进样量为10 μl。在此条件下DHMC达到基线分离。结果见图1。
A：DHMC对照品;B：山核桃叶;1：DHMC色谱峰
图1 DHMC对照品和山核桃叶HPLC图谱
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察精密吸取“2.1.2”项下的对照品贮备液1 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2、4、6、8、10 μl，注入色谱仪进行测定，记录色谱图，以对照品进样量为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，求得回归方程为：Y=7.886 8X-0.040 9(r=0.999 6)。结果表明，DHMC进样量在0.02～0.10 μg范围内呈良好的线性关系。标准曲线见图2。
图2 DHMC的标准曲线
2.3.2 精密度试验精密吸取0.004 mg/ml DHMC对照品溶液10 μl，注入色谱仪，重复进样6次，测定DHMC的色谱峰面积值，求得峰面积的RSD为1.1%(n=6)。
2.3.3 稳定性试验精密吸取“2.1.1”项下供试品溶液10 μl，注入色谱仪，按0、1、2、3、4、5 h间隔进样，测得DHMC的色谱峰面积，求得峰面积的RSD为0.9%(n=6)。结果表明，供试品溶液在室温条件下5 h内基本稳定。
2.3.4 重复性试验取同一批药材，按“2.1.1”项下的方法平行制备6份供试品溶液并依法测定DHMC的色谱峰面积，求得峰面积RSD为0.9%(n=6)，结果表明本法重现性良好。
2.3.5 加样回收试验取已知DHMC含量的山核桃叶粉碎，过40目筛，称取药材粉末约0.125 g，精密称定，研细，共称取6份，分别精密加入对照品贮备液(0.5 mg/ml)1.6、1.6、2.0、2.0、2.4、2.4 ml，再按“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，并依法测定，记录色谱峰面积，按外标法计算出DHMC的回收率分别为99.47%、99.71%、102.5%、101.4%、104.3%、102.3%，平均回收率为101.6%，RSD=1.8%(n=6)。
2.4 样品含量测定
取“2.1.3”项下的对照品溶液和“2.1.1”项下的山核桃叶供试品溶液各10 μl进样测定，按上述色谱条件测定峰面积，外标法计算含量，结果山核桃叶中DHMC的含量为7.916 mg/g，达0.79%。
3 讨论
试验过程中采用了100%、80%和60%的甲醇溶液提取，三者均可得到较好的分离效果，且测得的结果无明显差异，鉴于便捷性和稳定性考虑，采用100%甲醇为提取溶剂；在提取方法的选择上，采取超声提取和水浴回流提取两种方法作对比，二者测得的结果无明显差异，从简便和节能上考虑，采用了超声处理法提取；在流动相选择上，对两种洗脱系统进行比较，即乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(65∶35)，结果显示采用甲醇-水(65∶35)为流动相，峰形与分离效果最好，故选择甲醇-水(65∶35)为流动相。本实验首次对山核桃叶中的DHMC成分进行了方法学考察的研究，对提取时间、提取溶媒、提取方法及HPLC条件进行了筛选，初步为DHMC的质量标准化研究及含量测定建立了可靠简便的方法，也为山核桃叶的开发利用提供了宝贵的资料。
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[5]司传领,刘忠,惠岚峰,等 ......
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