串联序列amiRNA稳定转染后对cccDNA的影响(2)
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参见附件(3671KB，4页)。
1.1 材料
利用pcDNA6.2-G/W-EmGFP-miR表达载体构建的单一序列质粒表达载体amiRNA-HBV-4(简称amiHBV-4)，和串联序列质粒表达载体amiRNA-HBV3-4质粒(简称amiHBV3-4)为本实验室前期构建，已经琼脂糖凝胶电泳和基因测序验证构建成功。阴性对照质粒表达载体由美国Invitrogen公司提供。稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞系由第二军医大学附属长征医院的缪晓辉教授惠赠，本室保存。Lipofectemin2000转染试剂(美国Invitrogen公司)。稳定转染筛选细胞应用的主要试剂为杀瘟稻霉素/Blasticidin、G418(美国Invitrogen公司)。HBV cccDNA的检测采用上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒。HBsAg和HBeAg检测采用雅培试剂盒(购于美国Abboutt公司)，Axsym全自动免疫分析仪购自美国Abboutt公司。
1.2 方法
1.2.1 杀瘟稻霉素浓度的确定及细胞克隆的筛选 确定Blasticidin的最佳抑制浓度：由于抗生素Blasticidin的不同批次以及不同细胞敏感度不同，笔者制备了抗生素致死曲线来确定筛选浓度，即设定 Blasticidin梯度为0、2、5、10、15和20 mg/L 6个筛选浓度。取复苏后传代的第二代细胞，调整细胞密度为1.5×104/ml，每孔0.5 ml，加入24孔培养板，然后每孔加入含10%FBS的DMEM培养液0.5 ml，37℃传代培养，24 h后加入Blasticidin筛选。每3天换一次培养基，加入Blasticidin，每日显微镜下观察并记录细胞的生长情况，PBS洗净死亡的细胞。靶细胞抗生素最佳筛选浓度为可在3 d内导致大量的细胞死亡，并在2周内杀死所有细胞的浓度，作为转染后细胞筛选时的初筛浓度。笔者首先选择在瞬时转染实验中对HBV抑制效果最好的amiHBV-4、amiHBV3-4质粒和阴性对照质粒同时进行了瞬时转染，转染后筛选稳定细胞株。经对HepG2.2.15细胞以不同浓度的Blasticidin加压，根据细胞致死曲线变化，确定10 mg/L的浓度为筛选克隆株的初筛浓度，5 mg/L作为维持浓度。经Blasticidin和G418共同筛选6周后获得了稳定表达miRNA的单克隆细胞株，供进一步实验研究。共获取包括阴性质粒对照在内的稳转细胞株3株。再次送上海锐赛公司测序，结果证实插入序列均无变异，表明细胞株中的质粒DNA没有被破坏和发生变异。
1.2.2 cccDNA的检测 选择在瞬时转染实验中对HBV抑制效果最好的amiHBV-4和amiHBV3-4质粒和阴性表达质粒同时进行了稳定转染，筛选出稳定表达amiRNA质粒的稳转细胞株。应用上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒，取培养细胞提取的细胞内总DNA进行检测。具体操作均严格按照仪器和操作说明书进行。
1.2.3 稳定转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用 筛选出稳定表达amiRNA质粒的细胞株后，取各孔上清液按试剂盒说明进行检测。
1.3 统计学方法
所有数据输入Excel 表格，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。抑制率的计算方法：inhibitory rate(%)=[(Ccontrol-Ctester)/Ccontrol]×100%。
2 结果
2.1 稳定细胞株的筛选
经筛选获得了稳定表达miRNA的单克隆细胞(图1，见封三)，单克隆细胞扩增得到细胞株(图2，见封三)。
2.2 cccDNA的PCR检测
2.2.1 瞬时转染amiHBV后对HBV cccDNA的抑制情况(图3) 荧光实时定量PCR检测结果显示，相对于阴性对照质粒，瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%，降低值为1.996log10 copies/ml；amiHBV3-4组降低值为2.422log10 copies/ml，对HBV cccDNA的抑制率分别为58.4%。抑制率是以72 h各组cccDNA含量与阴性对照质粒组之间进行比较得出的结果，log10 copies/ml的结果是对表内数值取常用对数。
2.2.2 稳定转染amiHBV后对HBV cccDNA的抑制情况(图4) 相对于阴性对照质粒，稳定转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为93.78%，降低值为2.566log10 copies/ml；amiHBV3-4组对HBV cccDNA的抑制率为99.65%，降低值为2.592log10 copies/ml。该抑制率的计算是以各组cccDNA的检测平均值水平与阴性对照质粒组cccDNA的平均值相比较得出的结果，log10 copies/ml的结果是对表内数值取常用对数。
2.3 稳定转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用
因为HBsAg和HBeAg均为可溶性抗原，所以检测细胞上清液中的含量即可。检测结果显示，与HepG2.2.15细胞相比，转染了阴性质粒的稳定株的HBsAg和HBeAg的分泌差异无统计学意义(P>0.05)；而在转染的amiHBV-4质粒组和amiHBV3-4质粒组对HBV的表达均显示了显著的抑制效果(图5)，其中，amiHBV-4质粒组对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为96.50%和97.18%，amiHBV3-4质粒组为97.00%和96.97%(P<0.01)。
3 讨论
HBV DNA的复制机制较复杂，复制周期始于cccDNA，以其为模板利用宿主细胞的酶转录为前基因组RNA，逆转录为负链DNA，再合成正链DNA ......
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