串联序列amiRNA稳定转染后对cccDNA的影响(3)
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为排除转染效率对抑制效率的影响，郜玉峰等[12]针对HBV感染所需的宿主基因设计了amiRNA，并进行了稳定转染试验，在mRNA、DNA及蛋白质水平均验证了对HBV的复制和表达可达到持续抑制的作用。需要指出的是，从筛选到建立稳定株后的3个多月，病毒蛋白的复制和表达均被持久抑制，无明显波动，说明该质粒中的DNA不会轻易被细胞所排斥，能够持续存在。经稳定筛选得到的细胞株能够持续抑制HBV的复制和表达，使得amiRNA技术治疗慢性乙型肝炎具有潜在价值。该实验设计的干扰序列是针对HBV病毒感染和复制所需要的宿主细胞因素进行RNA干扰研究的，对人体的代谢等是否造成不良影响不得而知。本实验针对HBV的病毒基因设计串联序列amiRNA质粒，不会对人体自然存在的基因产生影响。
笔者进行稳定细胞株的筛选研究时，是根据所用质粒的耐药基因选择了Blasticidin和G418。G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过影响80 S核糖体功能而阻断蛋白质的合成，对原核和真核等细胞都有毒性。HepG2.2.15细胞中原先已经导入的HBV基因质粒中即带有G418的耐药基因，对它的耐药代表HBV复制基因的存在。Blasticidin属于核苷类抗生素，它能在原核生物和真核生物中抑制其蛋白的合成。amiRNA中的pcDNA6.2-G/W-EmGFP-miR表达载体中带有Blasticidin的耐药基因，对它的耐药代表amiRNA转染质粒的存在。对cccDNA的检测，最早应用的Southern blot法对操作者和仪器设备的技术要求较高，敏感性较低且不能准确定量，难以在临床常规开展。近年来有文献报道用PCR法、套式PCR法以及荧光探针检测技术的选择性PCR扩增法，使得检测的敏感性和实用性都得到了提高[13]。但由于HBV rcDNA和cccDNA序列有高度的一致性，应用PCR法仍可能会造成一定的假阳性率。为提高HBV cccDNA的检测精确度，一般基于其与rcDNA在生化(如对一些核酶的抗性等)和结构特性上的两个重要不同点来避免检测过程中的假阳性结果。①根据碱变性法抽提质粒的原理，细胞基因组DNA、病毒rcDNA和ssDNA(single strand DNA)因不是超螺旋分子，碱变性后在酸性环境下不能复性而被去除。cccDNA和质粒都是细胞内超螺旋的共价闭合环状双链DNA分子，一般不会被核酸外切酶如绿豆核酸酶等降解，而rcDNA可以被这些外切酶降解[14]。②cccDNA的两条共价互补链均是完整的并形成超螺旋结构，而rcDNA的正链和负链只是部分互补均有缺口，不能形成超螺旋结构；根据rcDNA和cccDNA在分子结构上的差异，将PCR引物分别设计在HBV DNA负链中缺口的两侧[15]，使rcDNA不能被扩增。郝勇等[16]单用跨缺口引物实时荧光定量PCR即可使cccDNA检测特异性提高104以上，在荧光PCR之前用特异性核酸酶消化模板，可将cccDNA检测特异性提高至105以上，可完全满足实验室和临床检测的需要。
本实验中使用的HBV cccDNA特异性荧光定量PCR检测试剂盒，先以绿豆核酸酶消化降解具有缺口的rcDNA，再于跨HBV DNA的双缺口区设计引物，使用TaqMan探针，进行PCR检测，从而减少了rcDNA在PCR扩增中的干扰，可以特异性地扩增所需cccDNA。但rcDNA的模板在PCR退火的过程中仍可被扩增，为防止上述情况，需在扩增前用外切核酸酶消化带有缺口的rcDNA[15]。有的检测试剂盒只是利用了选择性PCR扩增法的原理，本实验中采用的上海复星公司的HBV cccDNA PCR荧光实时定量检测试剂盒，是结合了这两个原理，先用绿豆核酸酶特异地降解rcDNA，减少了rcDNA在PCR扩增中的干扰。
虽然HBV是一个DNA病毒，但是其DNA的复制需通过基因组RNA为中介，使得RNA干扰抑制HBV DNA成为可能。相对于RNA病毒在其基因组复制时有一个高的变异率而言，DNA病毒较稳定，但每合成一个核苷酸仍有10-8～10-11的变异率，这样就可能存在一个预先存在的耐药突变位点，逃逸RNA干扰，这在关于HBV的最近研究中被证实[6]。针对病毒常逃逸RNAi作用的特点，有学者从对病毒感染和复制都必需的宿主细胞因素入手，导入多个化学合成的siRNA对宿主细胞进行RNA干扰等方面的研究，但是某些宿主基因为正常人体代谢所必需的，所以带来了一定的限制。本实验针对HBV病毒基因的两个位点设计了串联序列amiRNA质粒，该质粒为在前期的实验中构建且已经测序验证的。串联序列可同时靶向2个不同的位点，当一个位点变异逃逸RNAi，该质粒对另一位点序列仍然具有干扰效率。
前期笔者进行了瞬时转染的研究，实验结果显示，串联序列amiRNA-HBV3-4对HBV mRNA的抑制效率最佳，单一序列amiRNA-HBV-4的干扰效率较好；amiRNA-HBV-1和amiRNA-HBV-2的干扰效率分别低于30%，所以在串联序列的选取上就将1和2的序列舍弃。进一步研究了各质粒对细胞内HBV DNA和对病毒蛋白HBsAg、HBeAg的干扰效率。总体来看，amiRNA-HBV-4组和amiRNA-HBV3-4组对HBV的干扰效果较好，故本实验对二者瞬时转染后HBV cccDNA的情况进行了研究，amiRNA-HBV-4组的抑制率为21.9%，amiRNA-HBV3-4组为58.4%。稳定转染后amiRNA-HBV-4组对HBV cccDNA的抑制率达到了93.78%，而amiRNA-HBV3-4组为99.65%。稳定转染后两组对HBsAg和HBeAg的抑制率较瞬时转染时明显提高。实验证明，针对S区域的串联序列amiRNA介导的RNA干扰作用，对HBV的表达有明显的抑制作用，对DNA的复制根源的干扰作用更加明显。串联序列质粒干扰效率高的原因，考虑可能为：两个针对同一个基因的RNA干扰序列的设计，互补克服了可能存在病毒变异可能的缺陷；两个amiRNA序列，相当于两把锋利的剪刀，同时去剪一批绳子，剪断的速度比一把剪刀要快 ......
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