6,8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长(2)
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1.2.2 人肝癌裸鼠移植瘤模型制作及治疗实验 将人肝癌HepG2细胞按数量为2×106/只接种于BALB/c-nu小鼠背部皮下。按公式V＝W2×L×0.52计算移植瘤体积(W：移植瘤最短径，L：移植瘤最长径)，在瘤体积大约为100 mm3时，根据瘤鼠体重和瘤体积大致相等的原则分组，每组5只，共分为6组。Ⅰ组为生理盐水(0.1 ml/10 g)组，按0.1 ml/10 g体重剂量注射生理盐水；Ⅱ组为氟尿嘧啶(20 mg/kg)组，按20 mg/kg体重剂量注射氟尿嘧啶；Ⅲ组为白杨素(100 mg/kg)组，按100 mg/kg体重剂量注射白杨素(ChR)；Ⅳ组为低剂量dFMAChR(20 mg/kg)组，Ⅴ组为中剂量dFMAChR(40 mg/kg)组，Ⅵ组为高剂量dFMAChR(80 mg/kg)组，Ⅳ～Ⅵ组注射相应剂量的dFMAChR。以上各组均采用腹腔注射(ip)，隔日给药1次，共计10次，给药期间每4日测量鼠体重。最后一次给药48 h后，处死小鼠，割取移植瘤，称其重量，计算瘤重抑制率。瘤重抑制率计算公式：IR(%)=(1-实验组瘤重均值/对照组瘤重均值)×100%。
1.2.3 移植瘤的组织形态特征观察 取部分移植瘤，福尔马林固定后，用不同梯度浓度的乙醇溶液脱水6～12 h，二甲苯透明，浸蜡2～3 h，然后包埋、切片、脱蜡、HE染色，光学显微镜下观察移植瘤的组织形态特征。
1.2.4 TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡 石蜡切片常规脱蜡脱水，按TUNEL试剂盒的说明操作，DAB染色，光学显微镜下观察结果。细胞核着色，呈棕黄色或黄色为凋亡细胞。
1.3 统计学分析
采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 dFMAChR对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响
结果表明，dFMAChR对人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤的生长有显著抑制作用(P<0.05)，呈剂量依赖性(表1)，且比相应剂量白杨素抑制作用强。
2.2 dFMAChR对人肝癌裸鼠移植瘤组织形态的影响
HE染色，在光学显微镜下可见，生理盐水组：周围组织与肿瘤结节有清楚的分界，癌细胞为片状分布，大小不一，核多呈圆形，核仁明显，染色深浅不一，可见核分裂相。癌巢之间有少量血管及纤维(图1A，见封三)。表明人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤模型成功制备。氟尿嘧啶组：周围组织与肿瘤结节分界清楚，肿瘤中心区大片的坏死(核溶解、碎裂、固缩)，边缘残存的瘤细胞大小不一，核固缩多见(坏死)，核染色深浅不一(图1B，见封三)。表明化疗药物氟尿嘧啶具有有效杀伤人肝癌裸鼠移植瘤细胞的作用。白杨素组：周围组织与肿瘤结节有清楚的分界，可以看到肿瘤结节外周有完整的纤维包膜，癌组织片状分布，有少量血管及纤维分布于瘤巢之间，可见出血以及灶状坏死，癌细胞形态不规则，明显可见核仁，核呈圆形(图1C，见封三)。说明白杨素能杀伤人肝癌裸鼠移植瘤细胞。高剂量dFMAChR(80 mg/kg)组：癌细胞呈巢状分布，能观察到肿瘤细胞结节，可见少量纤维结缔组织间质分布于癌巢间，癌细胞胞浆丰富，明显可见核仁，核呈圆形，能观察到细胞凋亡(图1D，见封三)。说明高剂量dFMAChR具有较强地诱导人肝癌裸鼠移植瘤细胞凋亡作用。
2.3 dFMAChR对人肝癌裸鼠移植瘤细胞凋亡的影响
TUNEL法检测结果显示，生理盐水组：呈紫蓝色的为移植瘤细胞核(图2A，见封三)，凋亡呈阴性反应。氟尿嘧啶组：部分瘤细胞核呈黄色颗粒状(图2B，见封三)，凋亡呈中等阳性反应。白杨素组：呈棕黄色或黄色颗粒状的为移植瘤细胞核(图2C，见封三)，凋亡呈中等阳性反应。高剂量dFMAChR(80 mg/kg)组：呈棕黄色颗粒状为移植瘤细胞核(几乎全部细胞核染色)(图2D，见封三)，凋亡呈强阳性反应。说明dFMAChR(80 mg/kg)诱导人肝癌裸鼠移植瘤细胞凋亡作用较强。
3 讨论
从植物中寻找新型高效、低毒、不良反应少的抗癌药物已经成为当今新药研制的热点。广泛分布于植物界的黄酮类化合物生理活性多种多样，其抗肿瘤作用已引起国内外科研工作者的极大兴趣。虽然白杨素在体外具有良好的抗肿瘤活性，但白杨素在肠道内吸收甚少或者完全不吸收以及5、7位羟基在体内发生结合代谢引起其活性较低，从而使它应用于临床时受到限制[1]。因此改造白杨素结构，合成高效低毒的白杨素衍生物，成为众多学者研制新型抗癌药物的重要途径之一。
Khan等[3]发现甲基白杨素通过抑制COX-2和iNOS活性，上调p53、caspase-3和Bax的表达，抑制NF-κB、Wnt信号通路而发挥抗炎及抗肝癌作用。Mohammed等[4]合成的白杨素衍生物中，有些是比氨鲁米特(aminoglutethimide)更有效的芳香酶抑制剂，可作为抗癌药物预防和治疗雌激素依赖型肿瘤。笔者也发现白杨素衍生物如5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)、8-硝基白杨素、6-碘取代的白杨素衍生物等具有良好的抗癌活性[5-8]。
本研究在白杨素衍生物6，8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素(dFMAChR)有抗癌作用[1-2]的基础上，建立了人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤模型，进一步研究dFMAChR在体内抗肝肿瘤的治疗效果。结果证实，dFMAChR、白杨素和氟尿嘧啶均能抑制移植瘤的生长(P<0.05)，dFMAChR抑制作用呈剂量依赖性，且瘤重抑制率逐渐升高，说明dFMAChR体内抗肝癌活性较强。前期实验结果显示，生理盐水组与dFMAChR各剂量组相比，体重没有明显差异，但氟尿嘧啶组体重比生理盐水组显减轻(P<0.05)，说明dFMAChR的药物毒性较小，动物耐受性较好[9]，亦研究有结果表明，dFMAChR对小鼠Lewis肺癌皮下移植原发瘤及自发性肺转移、人宫颈癌裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用[1-2]，本实验结果与其类似。化疗药物治疗恶性肿瘤的主要作用方式是用药物诱导细胞凋亡，HE染色和TUNEL法检测结果进一步证实，dFMAChR具有较强地诱导人肝癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡作用，与氟尿嘧啶类似而强于先导化合物白杨素。研究结果反映dFMAChR具有良好的抗人肝癌治疗效果且毒性较小，为dFMAChR作为新型抗癌治疗候选药物提供了依据[9-10]。
[参考文献]
[1] 宋轶钦,陈忠东.6,8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长[J].湖南师范大学学报:医学版,2007,4(1):29-32.
[2] 王秋亚,王烨娟,高锦红.白杨素衍生物的合成及生理活性研究进展[J].化学研究,2011,22(1):96-103,110.
[3] Khan MS, Halagowder D, Devaraj SN. Methylated chrysin induces co-ordinated attenuation of the canonical Wnt and NF-κB signaling pathway and upregulates apoptotic gene expression in the early hepatocarcinogenesis rat model [J] ......
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