NKX2.5 基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2578KB，3页)。
1.2 实验方法
1.2.1 MSCs的原代培养与鉴定 大鼠MSCs的分离培养与鉴定参考已发表的文章[4]。
1.2.2 pEGFP-N3-NKX2.5真核表达载体的构建 NKX2.5与绿色荧光蛋白融合基因质粒构建按照《分子克隆实验指南》(第3版)和试剂盒操作说明完成。整个实验流程为：体外分离SD胎鼠心肌，组织匀浆后按照试剂盒步骤提取总RNA。RT-PCR方法扩增NKX2.5基因。并分别在上游引物的5′端引入Sal I酶切位点，下游引物5′端引入BamH I酶切位点，进行扩增。扩增后基因凝胶电泳，割胶回收靶片段。载体pEGFP-N3经BamH I、Sal I双酶切过夜胶回收4.7 Kb载体片段，将载体片段与先前获得的NKX2.5基因片段连接。上述连接产物转化并挑取单克隆，最终获得NKX2.5-pEGFP质粒。提取NKX2.5-pEGFP质粒，以用于转染MSCs。
1.2.3 MSCs细胞培养、转染和筛选 10%干血清DMEM、37℃ 5% CO2条件下培养MSCs细胞。取传代后P3代细胞，按Lipo2000转染试剂操作步骤转染NKX2.5-pEGFP质粒。转染之后48 h加入400 μl/ml的G418筛选2周。细胞长满后传代培养继续用G418加压筛选，通过荧光显微镜观察MSCs绿色荧光蛋白表达情况。
1.2.4 心肌梗死模型建立及NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs移植 40只SD大鼠制备心肌梗死模型，在呼吸机支持下经左外侧开胸切口暴露心脏。于左前降支下置7号缝合线结扎，成功者见左室前壁心肌活动障碍并有颜色变化。术后10 d心脏超声检测心功能后，将模型随机分为MSCs组(20只)和DMEM组(20只)，第2次开胸于心外膜瘢痕区边缘注射移植，MSCs组注射NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs 2×105/μl共计160 μl，分4点注入梗死区与正常心室组织交界处。对照组给予等体积无血清DMEM注射。
1.2.5 超声心功能检测 参考文献[5]方法，分别于模型制备后10 d (移植前)和移植后4周用超声检测心功能。以 HP小动物超声探头(15 MHz)在大鼠胸骨旁以二维超声和M型超声进行心脏功能检测。测量指标有室间隔厚度 (IVS)、 左室舒张末期内径 (LVEDD)、 左室收缩末期内径(LVESD)等。左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(FS)通过M型超声按HP5500的Teich模式获得。LVEF=(左室舒张末期容积-左室收缩末期容积)/左室舒张末期容积×100%。FS =(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%。
1.3 统计学方法
统计分析均在SPSS 11.0软件系统完成，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MSCs培养
体外分离MSCs，72 h后换液，见部分细胞贴壁生长呈梭形或条形，并有突起，细胞形态与成纤维细胞相似。原代培养第14天，细胞基本长至90%融合(图1)，以1∶3传代。传代细胞24 h贴壁，增殖较快，一般5~7 d可再次传代。
2.2 NKX2.5基因修饰后MSCs
构建的含有绿色荧光蛋白基因和NKX2.5基因的质粒转染MSCs后，按照常规操作培养，细胞长至90%融合后传代，继续培养并在荧光显微镜下观察细胞生长情况。结果显示，绿色荧光蛋白在MSCs中呈现绿色，证实质粒转染并表达成功(图2，见封三)。
2.3 大鼠心功能测定
40只SD大鼠制备心肌梗死模型后10 d，测定模型鼠心功能。将模型随机分为MSCs组和DMEM组，第2次开胸于心外膜瘢痕区边缘注射移植，MSCs组注射NKX2.5-pEGFP基因修饰后MSCs。DMEM组给予等体积无血清DMEM注射。术后4周再次测定心功能。移植后4周，MSCs组与DMEM组比较，心功能有明显改善，两组间LVEF和FS结果比较差异均有高度统计学意义(均P<0.01)。
3 讨论
心肌细胞属于永久性细胞，心肌细胞坏死后一般无法再生，需要通过新生肉芽组织并最终转化为纤维组织对坏死区心肌进行修复。多种细胞具有心肌修复功能，如心肌细胞[6]、骨骼肌卫星细胞[7]、平滑肌细胞[8]。但MSCs具有取材方便、增殖能力强，易于外源基因导入等优点，体外研究提示：MSCs能分化为心肌样细胞并可以与宿主心肌细胞形成缝隙连接，并可能产生同步收缩[9]。
NKX2.5基因心脏特异性表达特点显著，发育初期在脾、舌、胃和甲状腺等组织中有低度表达NKX2.5基因，但出生后心脏外器官中NKX2.5蛋白水平都显著下降。证明NKX2.5基因对多种器官发育都有着一定影响，尤其对心脏发育的影响作用更为明显[10]。
本研究利用基因工程和细胞治疗的方法，构建NKX2.5和绿色荧光蛋白融合基因质粒，并将该质粒转染入MSCs中，结果显示MSCs能够表达该融合基因。将基因转染后的MSCs在心肌梗死模型梗死区注射后，能够在一定程度上改善心肌梗死大鼠的心脏功能。该方法的建立及所获得的实验结果，为组织工程领域在心肌梗死方面的研究提供的新的参考，也具有较好的研究前景。但此过程中，所涉及的作用机制问题，有待于深入研究和进一步的探讨。
[参考文献]
[1] Tomita S, Micklee DA, Weisel RD, et al. Improved heart function with myogeness and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation [J]. J Thorac Cardiovasc Surg,2002,123(6):1132-1140.
[2] 王永,吴继雄.骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究进展[J].心脏杂志,2008,20(2):229-231.
[3] Reamon-Buettner SM, Hecher H, et al. Novel Nkx2-5 mutations in diseased heart tissues of patients with cardiac malformations [J]. Am J Pathol,2004,164(6):2117-2125 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2578KB，3页)。