如何建立新药的细菌内毒素检查方法(2)
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当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数(MVD)的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C·L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围(0.03～1.00 EU/ml)来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支(原料精密称取不低于10 mg的量)，按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液(供试品阴性对照，NPC)进行干扰检验，另外设立阳性对照(PC)、阴性对照(NC)、供试品阳性对照(PPC)，每个浓度平行做两管，最终得出供试品(批号：20100802)在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用(PPC首次出现“++”的浓度)的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。
只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释(低于最大有效稀释倍数)后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围(6.0～8.0)，可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证(干扰试验)，确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释(此时须进行干扰试验)。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数(MVD) 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查(普通凝胶法或动态浊度法定量试验)，如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药(或每毫升)中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时(但不低于最大有效稀释浓度MVC)对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。
[参考文献]
[1] Levin J, Bang FB. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin [J]. Thromb Diath Haemorrh,1968, 19(1):186-197 ......
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