食管癌放疗前后外周血癌胚抗原mRNA与蛋白检测的对比研究(2)
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参见附件(2523KB，3页)。
1.3 标本处理及RNA提取
放疗前及放疗结束两周内留取外周血10 ml(EDTA抗凝)，采用淋巴细胞分离液分离单核细胞，生理盐水洗涤后置于-80℃冰箱备用。同期收集20例食管良性疾病患者外周血及10例食管癌术后组织标本作为对照。采用Trizol一步法提取细胞和组织的总RNA，无RNA酶的DNase去除混杂的DNA，紫外分光光度计定量。
1.4 巢式RT-PCR
取1~2 μg总RNA，70℃ 5 min预变性后，依试剂盒说明进行cDNA合成。继而取4 μl cDNA行第1轮PCR扩增，取第1轮PCR产物0.5 μl行第2轮PCR扩增。PCR反应体系包括10×PCR buffer 2.5 μl(含Mg2+，终浓度在1.5 mmol/L)，dNTP mixture 2.5 μl(终浓度250 μM/L)，上下游引物各2 μl(20 pmol)，Taq酶0.15 μl，灭菌去离子水补足至25 μl。引物序列及反应条件参见文献[6]。取第2轮PCR扩增产物5 μl行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析，率的比较采取χ2检验或Fisher确切概率法，诊断效能通过受试者特征(receiver operating characteristic curve，ROC)曲线分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 放疗前CEA mRNA、蛋白表达
CEA mRNA检测典型PCR结果如图1所示。72例食管癌患者中，放疗前CEA mRNA阳性者为34例(47.2%，敏感性)，血清CEA蛋白升高者为16例(22.2%，敏感性)；而20例食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性者为0例(100%，特异性)，CEA蛋白升高者为2例(90%，特异性)。10例食管癌术后组织标本CEA mRNA表达均为阳性。CEA mRNA与CEA蛋白诊断食管癌的Youden指数(Youden指数是将灵敏度与特异度综合起来评价某种检查方法的真实性的指标，指数范围为0~1，Youden指数越大，真实性越大)分别为0.472与0.122，ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)分别为0.736与0.561(图2)，可见CEA mRNA的诊断效能显著优于血清CEA蛋白。
2.2 CEA mRNA、蛋白表达的临床病理联系
放疗前CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046)，与年龄、性别、肿瘤位置、病变长度、分期等因素无关；而血清CEA蛋白水平升高与食管癌临床病理特征均无关。见表1。
2.3 CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效的关系
放疗结束后评价，CR 8例，PR 39例，SD 20例，PD 5例，放疗前CEA mRNA、蛋白水平与放疗有效率无关，而放疗后CEA mRNA、蛋白变化与放疗疗效有关，CEA mRNA由阳性转阴或血清CEA蛋白水平下调提示放疗缓解率较好。见表2。
3 讨论
放射治疗是食管癌治疗的主要手段之一，由于食管的组织结构和自身生物学等方面的特点，相当一部分食管癌患者不宜手术或不愿手术而接受放射治疗。但多年来食管癌的放射治疗效果尚不理想，5年生存率不足10%，失败原因主要是局部未控或复发[7]，而肿瘤微转移可能在其中起到关键作用。因此，若能及时监测循环肿瘤细胞(CTC)，将对食管癌早期诊断及指导临床治疗具有重要价值[2]。由于受到人体免疫系统的清除，存活的CTC数量极少，对检测方法要求较高。RT-PCR技术具有高度灵敏性，可鉴别106~107个正常细胞中的一个肿瘤细胞，是目前最常用的方法[8]。
血清CEA是食管癌常用的肿瘤标记物之一，但一直存在敏感性低、特异性差的问题。近年来，以CEA mRNA为标记的CTC检测则展示出较好的前景，在乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌和宫颈癌等多种恶性肿瘤中得到广泛应用[3]。如Qiu等[9]报道，103例胃癌外周血CEA mRNA阳性占36.6%，CEA mRNA表达与肿瘤浸润深度和术后复发有关，并且，CEA mRNA比血清CEA蛋白在预测复发方面具有更好的敏感性。Ishigami等[10]则发现，胃癌外周血CEA mRNA拷贝数而非阳性率与术后复发有关。在食管癌中，Nakashima等[11]报道，外周血CEA mRNA阳性占57.4%(31/54)，且CEA mRNA阳性与淋巴结转移、肿瘤分期和术后复发有关，而血清CEA水平与之无关。Liu等[12]应用real-time PCR检测食管癌术前1 d(B-1)、手术当天(B0)和术后3 d(B+3)外周血中以CEA mRNA为标记的CTC数目，发现B-1与B0，B-1与B+3间均有统计学差异，且B+3/B0>0.4预示较高的转移风险；Tanaka等[13]也发现以CEA mRNA和鳞状细胞相关抗原(SCC)mRNA为标记的鳞状细胞癌相关抗原(CTC)是食管癌术后无进展生存的独立预后指标。上述结果都证实外周血CEA mRNA检测在食管癌中的应用价值。
本研究结果表明，食管癌根治性放疗前外周血CEA mRNA阳性与CEA 蛋白升高者分别占47.2%(34/72)与22.2%(16/72)，而食管良性疾病患者外周血CEA mRNA阳性与CEA 蛋白升高者分别为0与10.0%(2/20)，CEA mRNA的诊断效能显著优于CEA蛋白。且CEA mRNA阳性与淋巴结转移相关(P=0.046)，CEA蛋白升高与食管癌临床病理特征无关 ......
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