厄贝沙坦血浆蛋白结合率测定(2)
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2.1.2.2 厄贝沙坦储备液 称取105℃干燥至恒重的厄贝沙坦适量，精密称定，加空白透析液制成每1 ml含厄贝沙坦100 μg/ml的储备液，置4℃冰箱中冷藏备用。
2.1.2.3 供标准曲线用厄贝沙坦标准溶液 精密称取105℃干燥至恒重的厄贝沙坦对照品3.12 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为31.20 μg/ml的对照品储备溶液。精密吸取上述对照品储备溶液0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 ml分别置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。制得浓度为0.31、0.62、1.25、2.50、6.24、12.48、31.20 μg/ml的对照品溶液。
2.1.2.4 供透析用厄贝沙坦溶液 吸取上述厄贝沙坦储备液适量，加空白透析液制成浓度分别为0.2、2.0、20.0 μg/ml的厄贝沙坦溶液，置4℃冰箱中冷藏备用。
2.1.2.5 内标溶液 称取氯雷他定适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含氯雷他定10 μg/ml的对照品溶液，置4℃冰箱中冷藏备用。
2.1.3 透析液样品处理
精密吸取透析内液或透析外液100 μl，加内标溶液10 μl，涡旋混合2 min，加入乙腈100 μl，涡旋混合2 min，离心(16 000 r/min)10 min，取上清液，置50℃水浴，氮气吹干，残渣加流动相100 μl，涡旋混合6 min，离心(16 000 r/min)10 min，取上清液，即得。
2.1.4 透析液分析方法验证
2.1.4.1 专属性 在上述色谱条件下，厄贝沙坦和内标的保留时间分别为6.03、10.12 min，血浆中其他成分对测定无干扰。
2.1.4.2 标准曲线和线性范围 精密吸取空白血浆或空白透析液200 μl，加供分析方法验证用厄贝沙坦标准溶100 μl，制成厄贝沙坦浓度分别为0.10、0.21、0.42、0.83、2.08、4.16、10.40 μg/ml的标准样品溶液，按“透析液样品处理”项处理，注入色谱仪，测定峰面积。以厄贝沙坦与内标的面积比为纵坐标(Y)，厄贝沙坦浓度为横坐标(C)，线性回归。透析内液的线性方程为：Y=0.924 5C+0.025 6(r=0.999 0)线性范围为0.10~10.40 μg/ml，定量下限为0.10 μg/ml；透析外液的线性方程为：Y=0.844 9C+0.058 4(r=0.999 6)线性范围为0.10~10.40 μg/ml，定量下限为0.10 μg/ml。
2.1.4.3 精密度 精密吸取空白血浆或空白透析液200 μl，加厄贝沙坦储备液，制成低、中、高三个浓度的溶液(浓度分别为0.2、2.0、20.0 μg/ml)，按“透析液样品处理”项处理，注入色谱仪，测定峰面积。在同一天内连续进样5次及连续3 d测定，分计算日内精密度与日间精密度。结果显示，血浆样品高、中、低三个浓度的平均回收率分别为(99.1±8.2)%、(95.7±7.7)%、(102.4±9.8)%，日内精密度分别为5.27%、6.32%、6.88%，日间精密度分别为6.46%、6.73%、7.11%；透析外液样品高、中、低三个浓度的平均回收率分别为(99.7±3.2)%、(98.5±4.3)%、(99.6±4.1)%，日内精密度分别为3.22%、3.36%、3.07%，日间精密度分别为3.86%、4.13%、4.40%。
2.1.4.4 提取回收率 取“精密度”项低、中、高三个浓度的标准血浆样品溶液(浓度分别为0.2、2.0、20.0 μg/ml)，每个浓度5份，按“透析液样品处理”项处理，依法测定峰面积(A1)。另取以甲醇稀释的相应浓度对照品溶液，测定峰面积(A2)。按下式计算提取回收率(F)：F=(A1/A2)×100%。结果显示，高中低3种浓度的提取回收率分别是(80.9±7.4)%、(83.2±6.7)%、(78.4±6.6)%。
2.1.4.5 反复冻融稳定性 将“标准曲线和线性范围”项的标准血浆样品作为质控样品，进行冰冻融溶实验。样品置-20℃冰箱中反复3次冻融(分别于第1、3、7天融溶)，室温融溶后，依法测定样品浓度，每个浓度重复5份。结果显示，测定值与理论值的相对误差RSD<10%，表明血浆样品在-20℃下可稳定保存。
2.1.4.6 室温稳定性 取“反复冻融稳定性”项下的融溶样品处理后的进样测定前的分析液，室温下放置2、4、8、12 h，在上述时间点取样，依法测定浓度。结果显示，分析液室温放置12 h不影响含量测定。
2.2 血浆蛋白结合率实验
采用平衡透析法[6]测定厄贝沙坦的血浆蛋白结合率。吸取空白血浆2.0 ml注入处理好的透析卡中，置于200 ml不同浓度厄贝沙坦透析液(浓度分别为0.2、2.0、20.0 μg/ml，平行3份)的烧杯中，(37±1)℃平衡透析，分别于4、8、12、18、24、30 h吸取卡外透析液适量，置试管中加热至沸腾，再滴加5%乙酸检视，应无白色浑浊现象。取出卡内血浆，按“透析液样品处理”项处理，分别测定卡内血浆(C1)及卡外透析液(C2)中厄贝沙坦的浓度。按下式计算不同药物浓度水平的血浆蛋白结合率：血浆蛋白结合率(%)=(C1-C2)/C1×100%。结果见表1。
表1 厄贝沙坦血浆蛋白结合率(%)
3讨论
对厄贝沙坦及辅料在释放介质中的UV吸收特征进行考察，由扫描结果可知，厄贝沙坦溶液在245 nm处有一吸收肩峰，而辅料溶液在该波长处没有吸收，不干扰测定，所以选择245 nm作为检测波长。
实验中先后采用了不同比例的甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-磷酸二氢钾水溶液等作为流动相，结果发现，采用上述流动相，厄贝沙坦色谱峰均有不同程度的拖尾。采用乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调节pH值至2 ......
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