石决明清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的研究(2)
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参见附件。
2.3 蛋白成分检测
参考文献[6]的方法，SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析“2.2”项下序号为18、20、25、34、38、45收集管的蛋白组分(依据“2.2”项下各管OD280 nm值，OD280 nm值较大者入选)，空白对照用去离子水代替IEC分离样品，浓度为12%聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，考马斯亮蓝R-250溶液染色。
2.4 DPPH·清除活性分析
参考文献[7]的方法，对“2.2”项下各管收集物的DPPH自由基清除能力进行检测，反应体系包括：0.5 mg/ml样品溶液0.2 ml，2.0×10-4 mol/L DPPH溶液2.0 ml，加超纯水至反应总体积为4 ml。37℃水浴条件下避光反应30 min，空白实验以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，对照以等体积去离子水代替样品溶液，检测波长为517 nm。DPPH·清除率计算依据公式：
抑制率(%)＝■×100%
其中：Ax为加入样品的吸光度；Axo为样品的吸光度；Ao为未加样品的吸光度。
2.5 石决明样品处理及IEC色谱分析
石决明溶解于稀酸溶液，可观察到溶液变为黄褐色，除去不溶性物质后，经过离子交换层析，在280 nm处测定各管收集液光密度值，得到双峰洗脱曲线，第一个峰(对应第25管)洗脱时间长，峰型为不对称宽峰，推测该峰包含多种成分。第二个峰(对应第38管)洗脱时间短，峰型为尖峰，第38管分离液OD280 nm为1.875，位于峰尖位置，可能是一种组成比较简单的组分。见图1。
2.6 蛋白成分分析
SDS-PAGE电泳结果表明，与色谱峰相对应的第25和第38管溶液均显示出明显蛋白条带，而其余收集组分对应的条带明显减弱，第45管与对照组都没有显示出明显条带，所有蛋白条带均集中在18.4～25.0 kDa分子量标准Marker蛋白条带之间，说明经过IEC分离得到主要蛋白组分的分子量在18.4～25.0 kDa之间，与Michenfelder[8]从红鲍(haliotis rufescens)贝壳中获得的矿化连接蛋白AP24分子量相近。见图2。
MW为分子量(单位：kDa)；M为蛋白Marker；1为第18管收集物电泳条带；2为第20管收集物电泳条带；3为第25管收集物电泳条带；4为第34管收集物电泳条带；5为第38管收集物电泳条带；6为第45管收集物电泳条带；7为空白对照电泳条带
图2 石决明分段分离组分SDS-PAGE电泳
2.7 DPPH自由基清除能力测定
清除DPPH自由基活性测试结果表明，石决明溶液经过IEC色谱分离后的第18、38、55管以后各分离样品均具有较高DPPH自由基清除能力，第60管以后样品的DPPH自由基清除率能达到45%以上。第38管样品在280 nm处有最大吸收，而且蛋白电泳条带明显，说明石决明可能含有具有抗氧化活性的蛋白组分。见图3。
图3 石决明提取物对DPPH自由基清除率
3 讨论
石决明是临床常用的中药之一，由角质层、棱柱层和珍珠层组成，其有机组分主要存在于珍珠层。贝壳珍珠层与珍珠成分非常相似，而后者水提液能显著提高小鼠体内过氧化物歧化酶活性，降低过氧化产物水平[9-10]。有文献报道，珍珠层成分具有很高的活性氧自由基清除活性[11]，与本研究结论相近，推测贝壳珍珠层与珍珠具有相似的活性氧自由基清除活性成分，可以作为昂贵药用珍珠的理想替代品，具有广阔的应用前景。
本研究根据石决明酸溶性水提液组分在不同离子浓度条件下对羧甲基葡聚糖凝胶吸附力的不同，通过离子交换色谱，获得了含有不同蛋白成分的分离液，经过SDS-PAGE电泳分析发现，各收集管分离物的主要蛋白分子量均在18.4～25.0 kDa之间，而且含量与280 nm处光密度测量值呈正相关。IEC色谱分离液DPPH自由基清除能力结果表明，除部分组分的清除能力与蛋白含量显著相关外，其余样品与蛋白含量的多少不存在相关性。具有DPPH自由基高清除活性的第18、50管及以后各管组分，在280 nm处没有强吸收，也没有明显的蛋白电泳条带，说明石决明除含有抗氧化蛋白成分外，还存在可以清除DPPH自由基的其他高活性物质。因此，抗氧化药效成分可能是石决明药理学作用的物质基础，石决明抗氧化作用研究为进一步揭示贝壳类中药的药用机制提供了科学依据。
[参考文献]
[1] Chen H, Mai KS, Zhang WB, et al. Effects of dietary pyridoxine on immune responses in abalone, Haliotis discus hannai Ino [J]. Fish and Shellfish Immunology,2005,19(3):241-252.
[2] Marchant S, Haye PA, Marin SA, et al. Genetic variability revealed with microsatellite markers in an introduced population of the abalone Haliotis discus hannai Ino [J]. Aquaculture Research,2009,40(3):298-304.
[3] 陈玉枝,林舒.闽产鲍鱼壳中碳酸钙微量元素和氨基酸的分析[J].福建中医学院学报,1999,9(3):28-30 ......
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