补肾健脾养血活血法改善血管性认知障碍大鼠行为学障碍的研究(2)
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参见附件。
动物选用6个月龄雄性SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，体重为250～300 g，共70只。
复方中药康欣胶囊由福建屏山制药有限公司(批号：900418；规格：0.3 g/粒)提供。复方由女贞子、枸杞子、菟丝子、何首乌、黄精、黄芪、淫羊藿、当归、丹参、丹皮、酸枣仁、菊花、山楂等药物组成。简化方由黄芪、淫羊藿、丹参、当归组成。各组用药量2.43 g/kg，相当于人常用剂量。西药喜得镇由瑞士山德士药厂与天津华津制药厂合作生产[(91)卫药准字X-156号，1 mg/片]，混悬液浓度为0.027 mg/ml，相当于人常用剂量。硝普钠，由北京双鹤现代医药技术有限公司生产，批号：0305072。
1.2 血管性认知障碍动物模型的建立
VCI大鼠的造模方法：采用王蕊等[2]造模方法并加以改进：分将大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，常规消毒，取颈正中切口，钝性剥离结缔组织和颈前肌群，分离双侧颈总动脉，腹腔注射硝普钠2.5 ml/kg后，无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，再夹闭10 min，再通后，永久结扎右侧颈总动脉，并剪断。伤口洒青霉素粉适量，缝合伤口。假手术组手术过程同模型组，但不阻断双侧颈总动脉，不注射硝普钠，在手术过程中，保持动物肛温(37.0±0.5)℃。
1.3 分组与给药
造模前按随机数字表随机抽取10只为假手术组。其余大鼠进行造模。在造模后存活(术中死亡20只)的40只大鼠随机分为康欣胶囊复方中药组(复方组)、康欣胶囊简化方中药组(简方组)、西药对照组、模型组，每组10只。造模后第2周予以每日胃灌注(4.5 ml/kg各种液体)，假手术组和模型组用生理盐水灌胃，复方组、简方组和西药对照组分别予康欣胶囊全方、康欣胶囊简化方和喜得镇混悬液，均每日给药1次，连续灌药3周。给药两周后开始Morris水迷宫实验，共6 d，期间继续给药，次日处死动物。
1.4 行为学观察
Morris水迷宫[3]：水迷宫的水池直径100 cm，深50 cm，水深30 cm，水温(26±2)℃，水面覆一层泡沫塑料屑，池壁上4个等距离点分水池为4个象限，池壁外标4个入水点，任选一象限在其中央放置平台。平台无色透明，直径6 cm，高28 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围参照物保持不变。Morris水迷宫主要包括定位航行实验和空间探索实验两个部分。
定位航行实验：检测大鼠对平台位置的学习和记忆的能力。连续训练5 d，每日上午、下午两个时段，两次间隔8 h以上。在每个时间段训练4次，分别从4个象限的入水点将大鼠放入水中。如果大鼠在60 s内爬上平台，并停留3 s以上，则认为大鼠找到平台，此为潜伏期。如果60 s内大鼠未能找到平台，则拖拽其尾部，将其引导到平台，熟悉10 s，此时潜伏期按60 s计算。每次训练间隔为5 min。计算每一时段4个方向潜伏期的平均数，然后把每一日上午、下午两个时段潜伏期的平均数作为该日的游泳结果。
空间探索实验：测试大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。定位航行实验后，即在第6天上午，撤去平台，取任意一个入水点将大鼠放入水中，观察并记录60 s内大鼠穿过原平台区域的次数。
1.5 统计学方法
使用SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 造模后血管性认知障碍大鼠一般情况
麻醉药苏醒后大鼠活动能力下降，自发运动减少，少数大鼠自发运动增加。48 h内所有存活大鼠都逐渐恢复正常饮食及大便。
2.2 各组大鼠Morris水迷宫试验比较
与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；复方组、简方组、西药对照组与模型组比较，逃避潜伏期明显缩短，穿越平台区域的次数明显增多(P<0.05)；复方组、简方组、西药对照组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组大鼠逃避潜伏期及穿越平台区域次数比较(x±s)
注：与模型组比较，▲P<0.05，△P<0.05
3 讨论
临床和神经心理学研究表明，按照痴呆的诊断标准不能发现许多血管因素导致的认知障碍，尤其是未达到痴呆标准者，也就不能实现早期发现和早期预防。因此，一些学者提出应该用更宽泛的VCI概念来代替血管性痴呆，目的是将血管性痴呆的诊断从传统的痴呆标准中摆脱出来。VCI是一种可以预防的痴呆，早期治疗具有可逆性[4]。因此，广泛采用VCI诊断标准，对处于早期或症状前期的患者进行治疗及Ⅱ级预防和Ⅰ级预防，意义深远。
中医学认为，本病的发病与肾精不足、五脏亏虚、气血不足有密切关系。康欣胶囊以补肾健脾、养血活血为立法，方中女贞子、黄精等补肾填精，淫羊藿温肾壮阳，当归养血活血，佐以丹皮、山楂等药。药理研究表明，方中诸药多具有清除氧自由基、抗衰老、增强免疫力、抗动脉粥样硬化、减轻脑缺氧缺血后再灌注损伤等多种作用。既往的研究显示，康欣胶囊有效增加海马、下丘脑等部位乙酰胆碱(Ach)、多巴胺(DA)的合成；防止神经细胞凋亡，从而保护神经细胞，改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力[5-6]。
Morris水迷宫实验是检测空间方向、反射时间、视知觉和结构应用等空间学习记忆能力。本实验选用逃避潜伏期、通过平台次数等指标，来反映大鼠学习记忆能力。大鼠空间记忆力越好，其逃避潜伏期越短，通过平台次数也越多。本实验研究结果显示，假手术组大鼠的各指标均明显优于模型组，说明模型组大鼠出现明显的学习记忆障碍，造模成功。复方组、简方组、西药对照组与模型组比较，逃避潜伏期明显缩短、穿越平台区域的次数明显增多，说明各用药组均能明显改善大鼠学习记忆能力。
对于血管性认知障碍这个新概念，目前中医、西医都处于探索研究阶段。中医药在改善症状，延缓病程进展，减缓长期服用西药的不良反应，提高疗效等方面有一定的优势，因此通过本次动物实验观察，以期能为中医药对VCI的深入研究有所裨益。
[参考文献]
[1] 贾建平.重视血管性认知障碍的早期诊断和干预[J].中华神经科杂志,2005,38(1):4-6.
[2] 王蕊,杨秦飞,唐一鹏,等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进[J].中国病理生理杂志,2000,16(10):914-916.
[3] Morris R ......
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