HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度及其药动学研究(2)
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参见附件。
2.1.5 给药方法
临床上本品采用的给药方式为静脉滴注，故本试验采用将注射用比阿培南，并用100 ml 氯化钠注射液稀释，静脉滴注，滴注时间为1.0 h。根据说明书，注射用比阿培南的正常临床治疗剂量为静脉滴注，一次300 mg，12 h一次。故本试验采用低剂量组单次静脉滴注150 mg；中剂量组单次静脉滴注300 mg，高剂量组单次静脉滴注600 mg。多次给药，每次300 mg，每日2次。
2.1.6 样品采集
2.1.6.1 单次给药 受试者于试验前1周和试验期内均勿饮用酒类和咖啡类饮料，并在试验开始前一天进入Ⅰ期临床试验病房，晚上统一清淡饮食。受试者给药间隔依取血速度而定，通常间隔5 min。于给药前0 h、开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min，给药结束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h取血；受试者取血顺序同给药顺序。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。
2.1.6.2 多次给药 中剂量组10名健康受试者在单次给药结束后，继续进行多次给药，给药剂量为300 mg/次(药液稀释方法同单次给药)，每日2次，连续给药5 d，每次静脉滴注时间均为1 h(第5天只给药一次)。于第2、3、4、5天早给药前及第5天开始给药后15.0、30.0、45.0、60.0 min，给药结束后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h前臂静脉取血，每人4 ml，置于肝素试管中，分取血浆，于-20℃保存待测。受试者服药后应避免剧烈运动，亦不得长时间卧床。多次给药后3 d对受试者进行体检复查。
2.2 实验结果
2.2.1 方法专属性
在本实验所采用的色谱条件下，注射用比阿培南的保留时间为3.9 min左右，内标保留时间为9.7 min左右。注射用比阿培南和内标峰形良好，无杂峰干扰测定。提示本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的注射用比阿培南的浓度，灵敏度较高。见图1。
2.2.2 标准曲线和线性范围
取1.5 ml塑料离心管数支，量取空白血浆200 μl，置于离心管中，分别精密加入不同浓度的的比阿培南标准液，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.2、0.5、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0 μg/ml的标准含药血浆，各血浆含0.1 mg/ml内标20 μl，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作，制备一条标准曲线，并同时做空白样品，进行HPLC-UV分析。记录色谱图，计算比阿培南的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f(f = As/Ai)。以峰面积比值f对血药浓度C作权重回归计算，得回归方程：f=0.001 9+0.163 8C(权重系数w=1/C)，r=0.999 0，按上述条件测得比阿培南在血浆中的定量下限为0.2 μg/ml。
2.2.3 精密度与准确度
取1.5 ml塑料离心管数支，按“2.2.2”血浆中比阿培南标准曲线制备方法制备含比阿培南浓度分别为0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆(每个浓度做5份样品)及一条随行标准曲线，按“2.1.3”项下血浆样品的处理方法操作。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做3 d，共3批，每批每个浓度做5份样品，记录色谱图，计算比阿培南峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度。见表1。
表1 血浆中比阿培南的精密度
2.2.4 加样回收率试验
取1.5 ml塑料离心管数支，加入空白血浆0.2 ml，旋涡混匀，配成含比阿培南的浓度分别为0.5、5.0、40.0 μg/ml的标准含药血浆，计算比阿培南加样回收率。见表2。
表2 比阿培南加样回收率试验(n=5)
2.2.5 稳定性试验
取新鲜配制的比阿培南储备液和4℃放置4 d的比阿培南储备液，以甲醇-水(5∶95，V/V)稀释至5 μg/ml，各进行3样本分析，采用HPLC法测定。内标(5-羟基吲哚乙酸)储备液稳定性，方法同上，稀释至10 μg/ml，各进行3样本分析，结果表明，比阿培南和内标的标准溶液在4℃存放4 d性质稳定，RSD分别为1.58%和2.66%，均小于15%。
2.2.6 血药浓度测定结果
30名健康受试者单次静脉滴注150、300、600 mg后血浆中比阿培南的浓度-时间曲线。经DAS(drug and statistics，Version 2.0)程序处理，用一室模型计算药代动力学参数。主要药代动力学参数见表3，平均血浆药物浓度-时间曲线见图2。
3 讨论
据文献[3-5]报道，本品经肝脏代谢，经尿排泄。本品在体内稳定，主要以原形药存在于血和尿中，并通过尿液排泄，其中77%为原形，24 h的尿中回收率为99.3%。因此测定血浆的比阿培南可以不必考虑到药物代谢产物的影响。比阿培南作为一种较新开发的碳青霉烯类抗生素，其血药浓度测定方法还有待完善。
本实验采用甲醇和0.03%醋酸水溶液为流动相，与其他文献中使用C18柱相比，本实验中使用的是水性柱，通过HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度，可以使药品比阿培南和内标出峰迅速，灵敏度高。在该HPLC的检测条件下，血样的最低检测浓度可以达到0.2 μg/ml，可显著降低样品的测定体积，减少取样量，对进一步临床试验具有重要意义。本试验建立的人血浆中比阿培南的HPLC测定方法，其特异性、标准曲线、定量限、精密度、准确度及样品稳定性等均符合《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》的相关要求，适用于比阿培南药动学试验的研究。
[参考文献]
[1] 艾迪杰·巴亚斯.HPLC法测定人血浆中比阿培南的浓度[J] ......
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