耐亚胺培南铜绿假单胞菌的临床分离及耐药机制分析(2)
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参见附件。
表1 耐药基因PCR 引物序列
1.2 方法
1.2.1 细菌培养及分离 临床送检的各类标本严格按照《全国临床检验操作规程》进行细菌的分离培养。分纯后的铜绿假单胞菌用小牛血清保存至-80℃冰箱待用。
1.2.2 菌株鉴定及药敏试验方法 所有菌株均以BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用梅里埃ATB-Expression半自动细菌分析仪补充鉴定。药敏试验采用BD Phoenix 100革兰阴性细菌配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、阿莫西林/克拉维斯、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四环素、复方磺胺、多粘菌素E，共20种抗菌药物。
1.2.3 基因扩增 采用煮沸法提取模板DNA，oprD2基因扩增条件为：95℃预变性3 min, 然后95℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 60 s，循环35个周期，最后72℃延长5 min；其余基因扩增条件为：95℃预变性3 min，然后95℃ 60 s→55℃ 60 s→72℃ 60 s，循环35个周期，最后72℃延长5 min。取PCR产物4 μg经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统中观察结果。
1.2.4 PCR产物测序 使用DNA凝胶回收纯化试剂盒(购自TaKaRa)将PCR产物割胶纯化，送至深圳华大基因测序，序列登录GenBank进行比对分析。
2 结果
2.1 IRPA的分离率
从404株铜绿假单胞菌中检出IRPA 100株，分离率为24.75%。其中大多数分离自痰液标本90株，占90.0%，其次为血液和脓液标本，均为3株，各占3.0%，分离自伤口分泌物和胆汁标本均为2株，各占2.0%。
2.2 IRPA感染者科室分布
IRPA感染者主要来自重症医学科，占31.0%，其次为呼吸内科和神经内科，分别为20.0%和16.0%，具体科室分布情况见表2。
2.3 IRPA对抗菌药物的耐药性
100株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌，对阿米卡星的耐药率最低，为27.0%，耐药率在30.0%～50.0%的有4种抗菌药物：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦；耐药率在50.0%～70.0%的有4种抗菌药物：氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟；对其余10种抗菌药物的耐药率均>70.0%，其中，氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉和氯霉素的耐药率为100%。具体耐药情况见表3。
表3 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药情况
2.4 MBL基因及oprD2基因检测结果
100株IRPA中，检测到IMP基因阳性1株(PA47)，阳性率为1.0%，oprD2基因缺失65株(PA47为扩增阳性菌株)，阳性率为65.0%，其余耐药基因(VIM、GIM、SPM)均未检出。
2.5 IMP基因测序结果
通过对PA47菌株的IMP基因PCR产物进行正向测序，经Clustal W程序分析，其核酸序列与GenBank已登陆的blaIMP-9序列(登录号：AY033653)的同源性为100%，可判定为IMP-9型基因。PA47_blaIMP在GenBank的登录号为JN107561。
3 讨论
近年来，由于化疗、放疗、免疫抑制剂及各类侵入性诊疗项目在临床的广泛开展，非发酵类病原菌引起的医院感染逐渐增多，其中铜绿假单胞菌分离量占首位(45.4%)[2]。碳青霉烯类抗生素(亚胺培南、美罗培南等) 具有抗菌谱广、抗菌活性强、对β-内酰胺酶稳定性高等优点，已成为治疗IRPA感染最有效的抗生素[3]。然而，随着该类抗生素在临床治疗中的广泛应用，铜绿假单胞菌对它的耐药率也呈不断上升的趋势，中国CHINET细菌耐药性监测报道，1994~2001年中，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率由1994年的8.5%上升到2009年的30.5%[4-5]。
我院分离的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率为24.75%(100/404)，90.0%的菌株从痰液中分离得到，表明耐亚胺培南的铜绿假单胞菌多引起呼吸道感染，是医院获得性肺炎的首位病因，这和国内外诸多相关报道一致[6-8]。
在科室分布方面，我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌多来自ICU(31.0%)，这可能与患者多为急重症或昏迷阶段，免疫力低、病程和住院时间长、有手术史以及较频繁地大量使用广谱抗菌药物，造成菌群失调，易继发感染铜绿假单胞菌，且长时间在药物选择性压力下，耐药性菌株成为优势菌群，因此，这些科室分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌亦多为多重耐药菌株。
药敏实验结果显示(表3)，100株IRPA中，对阿米卡星的敏感性最好(73.0%)，其次是哌拉西林/他唑巴坦(63.0%)、哌拉西林(59.0%)、庆大霉素(58.0%)、头孢他啶(57.0%)，其余药物的敏感率均<50.0%。100株IRPA对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、氯霉素全部耐药。同处广东地区，我院IRPA对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的耐药率均<53.0%，而姚芬等[7]报道的耐药率达到95%以上，这可能跟不同医院临床用药习惯不同有关。由此可见，重视和加强细菌耐药监测，优先选用低耐药可能性的抗生素，合理应用广谱抗生素，将有助于避免IRPA引起医院感染流行。
铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制包括β-内酰胺酶的产生、外膜通透性的降低和主动外排系统的表达。金属酶(metallo-β-lactamases，MBL)是一类能够水解包括碳青酶烯类在内的所有β-内酰胺类药物的β-内酰胺酶，主要通过基因盒，整合子和转座子的形式传播。MBL包括四种类型：IMP型金属酶，已报道的超过19 种；VIM型金属酶，已超过11 种；SPM-1型金属酶和GIM-1型金属酶。MBL编码基因多位于整合子上，其中以IMP 型和VIM型 最为常见[1]。从实验结果看，2009 年1月~2010年12月收集的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中仅发现1株产IMP型金属酶菌株，提示产IMP 型金属酶是抗菌后效应(PAE)对IMP 耐药的机制之一。另外，我院检出的IMP型金属酶经分析为IMP-9型，具有该类型金属酶的铜绿假单胞菌曾在2000年于广州地区三家医院爆发流行[9]，需引起我院医院感染管理科的高度重视 ......
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