结肠癌患者淋巴细胞亚群改变与疗效关系的探讨(2)
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参见附件。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂 PE标记或FITC标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD25荧光抗体及同型对照抗体均购自美国BD公司；红细胞裂解液、淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲液(PBS)、1%多聚甲醛等均购自晶美生物试剂有限公司。
1.2.2 仪器 低速离心机、37℃恒温水浴箱、微量加样器以及流式细胞仪等。
1.3 方法
所有结肠癌患者术后均根据病情需要采用不同的化疗方案，化疗6个周期以上。在化疗前及化疗6个周期后分别进行检测。
检测方法：所有试验者采取清晨空腹外周静脉血约3 ml，给予肝素抗凝。使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞后送上级医院进行流式细胞检测。检测CD3+、CD4+、CD8+和CD25+等指标，分析各淋巴细胞亚群比例情况。所有操作严格按照试剂及仪器说明书进行。
1.4 疗效判定标准
化疗6个周期后，监测患者早期复发和远处转移的情况。治疗有效为无局部复发、CEA持续阴性、内窥镜检查未见病灶、CT或MR检查未发现占位病变、临床症状与体征无阳性表现、无远处转移。其他为无效。
1.5 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件进行统计学处理，数据以均数±标准差(x±s)表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组外周血淋巴细胞亚群的比较
在结肠癌患者外周血中，CD3+和CD4+细胞的比例分别为(55.36±11.19)%和(32.03±8.57)%，均较正常对照组显著下降，CD4+/CD8+的比值(1.05±0.28)也显著降低，而CD4+CD25+细胞的比例(9.87±4.21)%较对照组显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。这些结果说明在结肠癌患者中淋巴细胞亚群发生改变，患者免疫调节功能异常，机体处于免疫抑制状态。
2.2 结肠癌患者外周血淋巴细胞亚群与临床病理特征的关系
通过比较不同临床分期与不同组织类型结肠癌患者外周血淋巴细胞亚群的比例，笔者发现，患者临床分期越晚、组织分化程度越差，其外周血中CD3+和CD4+细胞的比例越低、CD4+/CD8+的比值越低，而CD4+CD25+细胞的比例越高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。这一结果说明结肠癌患者外周血各淋巴细胞亚群的比例与肿瘤的恶性程度密切相关。肿瘤恶性程度越高，患者免疫抑制状态越强。
2.3 化疗后结肠癌患者外周血淋巴细胞亚群的变化
结肠癌患者治疗后有效56例，无效29例。通过比较有效与无效组患者外周血淋巴细胞亚群，笔者发现，在有效组患者中外周血CD3+和CD4+细胞的比例、CD4+/CD8+的比值均显著高于无效组，而CD4+CD25+细胞的比例显著低于无效组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表3。说明治疗有效的患者机体的免疫抑制状态得到显著改善。
3 讨论
随着肿瘤免疫学研究的不断深入，人们的研究发现，肿瘤患者机体的免疫系统功能在肿瘤微环境的作用下产生了一定的改变，肿瘤细胞可通过释放大量免疫抑制因子进而导致机体免疫细胞的数量和比例发生异常，最终导致免疫系统功能的抑制[4]。由于机体免疫功能受到抑制，机体无法识别并清除肿瘤细胞，从而导致了肿瘤的发生与发展[5]。
大量研究表明，T淋巴细胞亚群在机体免疫系统中发挥了重要作用。CD4+和CD8+T细胞在免疫调节过程中极为重要，其比例和比值的多少反应了机体免疫功能的免疫状态与水平。CD4+/CD8+的比值越低，则机体的免疫应答反应能力越低。CD4+CD25+T细胞可通过分泌多种抑制性的细胞因子在机体免疫过程中起到抑制免疫的作用。这些淋巴细胞亚群维持一定的比例和功能是维持机体正常免疫调节能力的基础，它们共同参与了机体免疫应答的过程[6]。
已有报道显示，在肿瘤患者体内淋巴细胞亚群发生了改变，进而产生免疫抑制状态，促进了肿瘤的发生与发展[7]。笔者在本实验中通过检测结肠癌患者外周血淋巴细胞亚群发现，在结肠癌患者体内，CD3+与CD4+细胞的比例较正常对照组均显著下降，而CD4+/CD8+的比值也较对照组显著降低，CD4+CD25+细胞的比例较对照组显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果说明，在结肠癌患者体内淋巴细胞亚群发生了改变，其比例失衡，机体免疫功能受到抑制，进而促进了肿瘤的发展。
进一步笔者分析了结肠癌患者淋巴细胞亚群与结肠癌临床病理特征的关系，结果显示，患者临床分期越晚、组织分化程度越差，其外周血中CD3+和CD4+细胞的比例越低、CD4+/CD8+的比值越低，而CD4+CD25+细胞的比例越高。这一结果说明，肿瘤恶性程度越高，患者免疫抑制状态越强。通过比较治疗有效与无效的结肠癌患者淋巴细胞亚群的变化发现，在治疗有效的患者中外周血CD3+和CD4+细胞的比例、CD4+/CD8+的比值均显著高于无效组，而CD4+CD25+细胞的比例显著低于无效组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明治疗有效的患者可能由于机体的免疫抑制得到改善进而提高了疗效。
总之，检测结肠癌患者淋巴细胞亚群有助于了解机体的免疫功能，通过比较治疗前后患者淋巴细胞亚群的变化，可对患者的治疗效果进行判断，对临床治疗有一定的指导意义。
[参考文献]
[1] Yee YK, Tan VP, Chan P, et al. Epidemiology of colorectal cancer in Asia [J]. J gastroenterol Hepatol,2009,24(2):1810-1816.
[2] Greifenberg V, Ribechini E, Rssner S, et al. Myeloid-derived suppressor cell activation by combined LPS and IFN-gamma treatment impairs DC development [J] ......
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