Ras相关核蛋白和缺氧诱导因子HIF-1α在胃癌组织中的表达及临床意义(2)
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参见附件。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集湘潭市中心医院2009年5月~2011年5月手术切除的胃癌标本及其配对的距癌灶5 cm以上的癌旁组织标本各70例，标本均经组织病理确诊，患者术前均未接受放化疗。其中，男40例，女30例，年龄35~76岁，中位年龄58岁，胃癌患者临床分期按2003年国际抗癌联盟(UICC)颁布的胃癌TNM分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期21例，Ⅲ期33例，Ⅳ期9例；胃癌分化程度：低分化腺癌26例，中分化腺癌29例，高分化腺癌15例；胃癌浸润深度：浸润黏膜层及黏膜下层(T1)5例，浸润固有肌层(T2)19例，浸润浆膜层(T3)34例，浸润邻近器官或组织(T4)12例；淋巴结转移：无转移27例，有转移43例。
1.2 主要试剂
鼠抗人HIF-1α单克隆抗体、兔抗人Ran多克隆抗体及其他相关试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 检测方法
每个石蜡标本4 μm厚度连续切片，摊片后，切片放置于60℃温箱烘烤2 h预处理。采用免疫组织化学染色PV9000二步法，具体步骤如下：切片60℃预热30 min。石蜡切片常规脱蜡水化(二甲苯脱蜡10 min×2，梯度酒精水化95% 3 min ×3，80% 3 min，70% 3 min，蒸馏水5 min×2)。煮沸修复：取一定量枸橼酸盐缓冲液(pH =6.0)于不锈钢压力锅中加热至沸腾，切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热6 min)，计时2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，先用蒸馏水冲洗3 min×3，然后用PBS(pH =7.2~7.4)冲洗3 min×2。3%过氧化氢室温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加一抗，室温下孵育1 h，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加聚合物辅助剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗3 min×3。除去PBS液，滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，室温孵育30 min，PBS冲洗3 min ×3。除去PBS液，滴加新鲜配制的DAB底物显色液，显微镜下观察3~5 min，至出现阳性结果而又无明显背景着色，中止反应，自来水冲洗。苏木素复染，1%盐酸分化，氨水反蓝，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗，步骤同上，作阴性对照。
1.4 免疫组化结果判定
以细胞胞浆或胞膜出现黄色颗粒为阳性，根据细胞染色强度及染色细胞所占百分比计分，以计分之和来判断结果，按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占百分比评分：阴性为0分，阳性细胞数<10%为1分，10%~24%为2分，25%~49%为3分，≥50%为4分。按计分之和分为4个等级：-(0)；+(1，2)；++(3，4)；+++(5，6)，计分之和>2分为高表达，≤2为低表达。
1.5 统计学方法
应用SPSS 17.0统计学软件处理实验数据，计数资料组间比较采用χ2检验，等级相关资料采用Spearman等级相关检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ran和HIF-1α在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达情况
Ran和HIF-1α的阳性表达主要在细胞核，部分胞质中也可见阳性表达，胃癌组织中Ran和HIF-1α的阳性表达率分别为45.71%.和77.14%，与正常胃黏膜组织比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1~2。
2.2 Ran和HIF-1α在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系
2.2.1 Ran在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系 Ran在T1、T2、T3、T4的阳性表达率分别为20.00%(1/5)、26.32%(5/19)、47.06%(16/34)及83.33%(10/12)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为14.29%(1/7)、33.33%(7/21)、51.52%(17/33)及77.78%(7/9)；淋巴结转移组的阳性表达率为62.79%(27/43)，无淋巴结转移组的阳性表达率为18.52%(5/27)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。但Ran表达与肿瘤分化程度无明显关系，差异无统计学意义(P > 0.05)。见表3。
2.2.2 HIF-1α在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系 HIF-1α在T1、T2、T3、T4的阳性表达率分别为40.00%(2/5)、63.16%(12/19)、85.29%(29/34)及91.67%(11/12)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的阳性表达率分别为42.86%(3/7)、66.67%(14/21)、84.85%(28/33)及100.00%(9/9)；淋巴结转移组的阳性表达率为88.37%(38/43)，无淋巴结转移组的阳性表达率为59.26%(16/27)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。但HIF-1α表达与肿瘤分化程度无明显关系，差异无统计学意义(P > 0.05)。见表4。
2.3 Ran和HIF-1α在胃癌组织中相关性
Ran和HIF-1α在胃癌中的表达，经Spearman等级相关统计学处理(r = 0.363，P < 0.05)，两者呈正相关。见表5。
表1 Ran在胃癌组织和正常胃黏膜组织中免疫组化染色的情况
3 讨论
Drivas等[5]首次在人畸胎瘤细胞cDNA中发现Ran的开放阅读框，并分离纯化证实Ran具有GTP酶活性，研究发现Ran可激活Cdc2/cyclin B蛋白激酶使细胞进入有分裂期[6]，Ran的功能异常可以促进细胞转化和肿瘤发生[7] ......
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