生脉注射液对创伤失血性休克大鼠免疫功能的影响(2)
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[Key words] Hemorrhagic shock after trauma; Shengmai Injection; lympholeukocyte; Immune
对创伤失血性休克的研究长期以来一直是临床和科研工作者的热点和难点问题。随着人们对休克微循环理论和创伤急救技术的提高，创伤失血性休克的早期死亡率已明显下降，而后期因感染导致的死亡率则相对升高。近年来，人们已经开始密切关注创伤失血性休克后免疫功能的变化，并且从不同角度研究创伤失血性休克后免疫功能改变对机体的影响。目前临床上对创伤失血性休克后免疫功能紊乱的防治主要集中在如何抑制过度的炎症反应、如何提高创伤后机体受抑制的免疫功能等方面。在尚未找到安全有效的免疫调节药物基础上，人们把目光逐渐转向了中医中药研究。与西药相比，中药成分多样化，药理作用广泛复合，不少中药对免疫具有双向调节作用，且副作用小，来源广泛，价格便宜，有很大的利用空间，故其对免疫功能的作用正日益受到人们的重视。随着中医药科研方法的进步，很多补益类中药，无论健脾、补肾、滋阴、壮阳，只要用药对证(指补虚药针对虚证状态)，都可增强细胞免疫，这几乎已成为补虚药的共性。生脉注射液是目前研究较多的经典方剂，本研究旨在探讨大鼠创伤失血性休克后免疫功能的改变以及应用生脉注射液后其免疫功能的变化情况，以期为临床用药及进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，清洁级，雄性，体重(200±20)g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供[生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002]。分6笼饲养，每笼5只，标准鼠料喂养，自然光照，室温22～26℃，湿度45%～65%，动物自由摄水和进食。适应性饲养3 d后正式实验。
1.1.2 主要试剂 ①生脉注射液：江苏苏中药业集团股份有限公司；规格：20 mL/瓶，批准文号：国药准字Z32021056。②小鼠抗大鼠CD3-FITC抗体：美国Invitrogen/Caltag公司提供；批号：83-MR5301。③小鼠抗大鼠CD4R-PE抗体：美国Invitrogen/Caltag公司提供：批号：83-MR5104。④小鼠抗大鼠CD8 PE-Cy5(PC5)抗体：美国Invitrogen/Caltag公司提供；批号：83-MR5206。⑤溶血素(FCMlysing Solution 100T)：美国MBA公司提供；批号：11-MBA-LS01。⑥磷酸盐缓冲液(PBS，PH=7.2~7.4)：福州迈新公司；批号：60906006OR。⑦0.9%氯化钠注射液、林格液、2%戊巴比妥钠、10%中性甲醛、肝素等，均为上海中医药大学附属普陀医院动物实验室提供。
1.1.3 主要仪器 流式细胞仪：美国BD公司；全自动生化分析仪：7600-010型，日立仪器(苏州)有限公司；低温高速离心机：J2、HS型，美国Bekman公司；微量移液器：德国Eppendorf公司；手术器械：眼科剪、持针器、弯钳、医用缝线等。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组 动物被随机分为3组，即正常对照组(A组)，创伤失血性休克组(B组)，生脉注射液治疗组(C组)，每组各10只。C组大鼠在造模手术开始前2 d，腹腔注射生脉注射液，每日1次，每次3 mL，直至实验开始后第3天为止，共5 d。B组在实验开始前2 d，腹腔注射与生脉注射液治疗组等体积的生理盐水，每日1次，每次3 mL，直至实验开始后第3天为止，共5 d。A组不予任何处理。各组大鼠分别于造实验开始后的第3天处死，收集血液及胸腺、脾脏标本。
1.2.2 动物模型建立方法 参照庞荣清[1]、张匀等[2]的创伤失血性休克动物模型制作方法[3]。①SD大鼠30只，实验前12 h禁食，4 h禁水，术前称重，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉，麻醉成功后固定于手术台上。②失血：造模大鼠麻醉成功后剪开右后肢皮肤及皮下组织，暴露股动脉，于股动脉按公式[4] [鼠重(g)×75 mL/1 000 mg×(0.2~0.3)]抽血(约5 mL)，止血后无肉眼可见出血，缝合皮肤。③断股骨：用夹钳钳夹大鼠双侧股骨中段，听到咔嚓声后，手中有骨摩擦感，即造成大鼠双侧后肢股骨骨折。④手术完成后维持大鼠创伤失血性休克0.5 h，于阴茎静脉补充失血量两倍的平衡溶液补充血容量。⑤大鼠末次给药30 min后抽血处死，血液肝素抗凝后待检。
1.2.3 血常规检测 将肝素1∶25抗凝后的全血于采血后2 h内用全自动生化分析仪进行血常规检测，上机前摇匀，防止血液分层。观察血常规中白细胞(white bloodcell count，WBC)、淋巴细胞(lympholeukocyte，LY)、中性粒细胞(granulocyte，GR)比例变化。
1.2.4 T淋巴细胞亚群含量测定 将肝素1∶25抗凝后的全血于24 h内进行T细胞亚群含量测定。①取大鼠全血100 μL，放在分别标有A、B、C的试管中。②A管分别放入CD3 FITC(为荧光素5-异硫酸盐异构体-Fluorescein Isothiocyanate，FITC)和CD4 PE(荧光巯基化藻红蛋白-Phycoerythrin，PE)荧光标记抗体，各20 μL；B管分别放入CD 3FITC和CD8 PC5(荧光藻红蛋白染料-Phycoerythrin-Cy5，PC5)荧光标记抗体，各20 μL；C管分别放入CD8 PC5和CD4 PE荧光标记抗体，各20 μL。③混匀后，室温避光孵育30 min。④于A、B、C试管中分别加入红细胞裂解液2 mL，室温避光孵育10 min。⑤于离心机1 500 r/min离心5 min，去上清。⑥将10%PBS(磷酸盐缓冲液-Phosphate Buffered Saline，PBS)溶液1 mL分别加入A、B、C试管中，充分混匀 ......
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