葡萄糖浓度波动对INS-1细胞胰岛素分泌的影响(2)
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参见附件。
1.2.3 测定的指标及方法 分组干预结束后，用荧光素酶法检定细胞ATP含量，分别用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1细胞1 h，收集上清后放免法测定其胰岛素分泌水平，分别作为基础和高糖刺激下胰岛素释放，计算高糖刺激胰岛素分泌/基础胰岛素分泌作为胰岛素分泌能力结果。结果均以胰岛细胞总蛋白校正。
1.3 统计学方法
数据用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析，各组内均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，若方差不齐采用Welch近似方差分析；多重比较采用LSD法(Least-significant difference test)，两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1 细胞胰岛素分泌水平的影响
六组基础胰岛素分泌(2.8 mmol/L 葡萄糖刺激)差异无统计学意义(P > 0.05)，高糖刺激胰岛素分泌(16.7 mmol/L葡萄糖刺激)差异有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
表1 六组INS-1细胞的基础胰岛素分泌及高糖胰岛素分泌(x±s，n=5)
2.2 不同浓度葡萄糖及抗氧化剂对INS-1 细胞ATP含量及胰岛素分泌能力的影响
由表2可知，与正常糖组相比，持续性高糖组及波动组的胞内ATP含量及胰岛素分泌能力显著下降(P < 0.01)，且波动组下降更明显。使用抗氧化剂NAC干预持续性高糖组及波动组，两组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力均较未使用组显著增加(P < 0.05)。
3 讨论
近年来，血糖波动的危害越来越受到关注，研究发现波动性高血糖不仅促进糖尿病慢性并发症的发生和发展[5-7]，也可损伤β细胞的胰岛素分泌功能[1-2]。本研究发现，波动性高糖及持续性高糖均可损伤INS-1细胞的胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。
已有研究发现，胰岛β细胞胰岛素分泌与ATP合成相偶联[3-4]。葡萄糖刺激胰岛素分泌的重要机制是葡萄糖增加ATP的合成，减少游离二磷酸腺苷，导致ATP敏感性K+通道关闭，细胞去极化，Ca2+通过钙电压门控通道内流，并产生一系列的级联放大效应使胰岛素分泌颗粒胞吐，胰岛素分泌到细胞外[4]。本研究结果发现，ATP含量在持续性高糖组及波动组均较正常糖组显著下降，且波动组下降更明显。本研究提示，波动性高糖及持续性高糖可能通过降低INS-1细胞的ATP生成降低其胰岛素分泌能力，且波动性高糖更严重。
高糖可引起胰岛β细胞功能紊乱，胰岛素分泌功能受损，其机制较复杂。近年来大量文献证实氧化应激在β细胞的损伤中发挥的重要作用[8]。胰岛β细胞系INS-1细胞株表达氧自由基清除酶少，对氧化应激损伤高度敏感，本实验采用该细胞株进行研究。已有多篇文献证实抗氧化剂NAC能够保护胰岛β细胞的分泌功能[9]，本研究用NAC处理后发现，NAC+波动组及NAC+持续高糖组的细胞ATP含量及胰岛素分泌能力分别较波动组及持续高糖组显著增加，抗氧化剂可以显著改善细胞ATP及胰岛素分泌能力，提示波动性高糖及持续性高糖导致ATP合成减少可能与氧化应激有关。
综上所述，波动性高糖及持续性高糖可能通过氧化应激使ATP合成减少，且波动性高糖的程度更严重，最终导致INS-1细胞胰岛素分泌功能的损伤。这为以后改善ATP合成以减少β细胞高糖毒性提供更多的理论依据。但波动性高糖及持续性高糖使ATP合成减少的许多具体机制仍未证实，有待进一步的研究。
[参考文献]
[1] Hou ZQ，Li HL，Gao L，et al. Involvement of chronic stresses in rat islet and INS-1 cell glucotoxicity induced by intermittent high glucose [J]. Mol Cell Endocrinol，2008，291(1-2)：71-78.
[2] Qiu P，Zhao TY，Li XJ， et al. Damage mechanism of intermittent exposure to high concentrations of glucose to beta cell lines (HIT-T15 cell) [J]. Sichuan Da Xue Xue Bao：Yi Xue Ban，2008，39(1)：69-71，93.
[3] Maechler P，Wang H，Wollheim CB. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase [J]. FEBS Lett，1998，422(3)：328-332.
[4] Rutter GA. Visualising insulin secretion. The Minkowski Lecture 2004 [J]. Diabetologia，2004，47(11)：1861-1872
[5] Azuma K ......
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