RP-HPLC同时测定克银颗粒中的靛蓝和靛玉红(2)
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参见附件。
A.靛玉红对照品；B.阴性对照样品；C.克银颗粒样品；a.靛蓝峰；b.靛玉红峰
图2 靛玉红对照品、阴性对照样品、克银颗粒样品HPLC色谱
2.4 线性关系考察
取“2.1”项下靛蓝对照品储备液，用甲醇逐步稀释成0.329、1.650、3.290、8.225、16.450、24.680、32.900 μg/mL，取适量靛玉红对照品储备液逐步稀释成0.390、1.850、3.900、9.250、18.500、28.750、39.000 μg/mL系列浓度的对照品溶液，在上述色谱条件下进样，以对照品浓度C为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得到靛蓝和靛玉红靛蓝标准曲线回归方程分别为Y = 56.94C-1.749(r = 0.999 8)；Y = 119.1C+19.71(r = 0.999 9)。结果表明靛蓝在0.329～32.900 μg/mL范围内，靛玉红在0.390～39.000 μg/mL范围内，药物浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 稳定性试验
取供试品溶液，在配制后0、4、8、12、24 h于靛蓝和靛玉红的色谱条件下分别进样，靛蓝、靛玉红峰面积的RSD分别为0.86%和0.79%。结果表明样品溶液在室温下24 h内稳定。
2.6 精密度考察
取靛蓝和靛玉红对照品溶液(靛蓝浓度为16.45 μg/mL、靛玉红浓度为18.50 μg/mL)，于各自色谱条件下同一天连续进样5次，测定峰面积，计算靛蓝和靛玉红日内RSD分别为0.78%和0.88%；连续3 d进样5次，测定峰面积，计算靛蓝和靛玉红日间RSD分别为1.03%和1.12%。结果表明仪器与色谱条件具有良好的精密度。
2.7 重复性试验
取同一批样品6份，分别按样品测定方法测定。每10 g克银颗粒中靛蓝的平均含量为69.850 mg，RSD = 0.92%；靛玉红的平均含量为2.622 mg，RSD=1.01% 。
2.8 加样回收率试验
精密称量已知靛蓝和靛玉红含量的克银颗粒(每克颗粒剂含靛蓝6.985 0 mg，含靛玉红0.262 2 mg)1.103 g，加DMF 50 mL，超声30 min用甲醇定容至100 mL量瓶中，过滤，平行取6份续滤液各1 mL，分成3组，每组2份，分别加入靛蓝对照品溶液(82.25 μg/mL)0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。另平行取6份续滤液各5.0 mL，分成3组，每组2份，分别加入靛玉红对照品溶液(97.50 μg/mL)0.1、1.0、3.0 mL，甲醇定容至10 mL。分别于不同波长的色谱条件下进样，记录色谱图，按外标法计算靛蓝和靛玉红的含量，并计算加样回收率。结果见表1。
表1 靛蓝和靛玉红的加样回收率试验结果
2.9 样品含量测定
取3批样品，分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按上述色谱条件分别测定其含量，按外标法计算靛蓝与靛玉红的含量，结果3批样品中每袋含靛蓝平均值为68.82 mg，靛玉红平均值为2.54 mg。结果见表2。
3 讨论
《中国药典》2010年版采用液相色谱测定青黛中的靛蓝和靛玉红进行控制质量。靛蓝和靛玉红为同分异构体，脂溶性均较强，在很多试剂中溶解性较差，《中国药典》2010年版测定青黛中靛蓝的含量时，用2%水合氯醛的三氯甲烷溶液作为溶剂进行超声处理，以606 nm作为检测波长，笔者发现很多液相的紫外-可见检测器无606 nm的设置。采用600 nm测定靛蓝的含量，灵敏度低，重复性差且误差大，与文献[3]报道一致。故本文采用检测波长为287 nm和292 nm分别来测定靛蓝和靛玉红含量，效果较好。
有文献先用三氯甲烷回流溶解后再用异丙醇和甲醇逐步稀释的方法配制对照品 ......
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