高效液相色谱法同时测定克洛己新干混悬剂中头孢克洛和盐酸溴己新的含量(2)
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参见附件。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
以CAPCELL PAK C18 MGⅡ(5 μm，4.6 mm×250 mm)为色谱柱，0.005 mol/L四丁基氢氧化铵溶液(用磷酸调节pH至3.2)-甲醇(45∶55)为流动相；用双波长同时检测，波长为254、249 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量为20 μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取盐酸溴己新对照品40.12 mg，置20 mL的量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为盐酸溴己新对照品浓溶液。另精密称取头孢克洛对照品42.98 mg，置50 mL的量瓶中，同时精密量取上述盐酸溴己新对照品浓溶液1 mL置该量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。
2.3 样品溶液的制备
取本品10袋的内容物，研细，混匀，精密称取适量(约相当于盐酸溴己新8.77 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解，超声处理15 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液5 mL置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
按处方不加头孢克洛和盐酸溴己新，参照“2.2”项下方法操作，即得。
2.5 干扰试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下条件测定。结果表明，阴性样品中在与头孢克洛和盐酸溴己新对照品保留时间相应的位置无色谱峰，说明处方中其他组分对测定无干扰。色谱见图1。
2.6 线性关系的考察
在“2.1”项色谱条件下，精密量取上述储备液2、5、8、10、12、15、18、20 μL，分别进样，以进样量对峰面积进行线性回归，得头孢克洛的回归方程为：Y = 6 025 403.785X-1 338 205.098，相关系数r = 0.996 1，盐酸溴己新的回归方程为：Y= 13 157 845X+118 116.31，相关系数r = 0.999 2。结果表明，头孢克洛进样量在1.602～16.020 μg范围内，盐酸溴己新在0.080 24～0.802 40 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.7 检出限及定量限测定
精密量取1 mL对照品溶液置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样1 μL，确定检出限(S/N=3)，头孢克洛为0.016 02 μg，盐酸溴己新为0.000 802 4 μg；进样5 μL，连续进样5次，测定峰面积，计算得RSD头孢克洛为1.2%，盐酸溴己新为1.6%；确定定量限(S/N=10)，头孢克洛为0.080 11 μg，盐酸溴己新为0.004 012 μg。
2.8 仪器精密度试验
精密量取对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算得头孢克洛和盐酸溴己新的RSD分别为0.34%和0.62%，表明精密度良好。
2.9 稳定性试验
按“2.3”项下制备的样品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h进样10 μL分析，测定头孢克洛和盐酸溴己新的峰面积并计算其RSD，头孢克洛为0.72%，盐酸溴己新为0.86%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.10 加样回收试验
精密称取批号为110207的样品2.735 2、2.876 1、2.785 1、2.767 9、2.803 1、2.791 8、2.784 2、2.808 5 g，置50 mL量瓶中，以第1、2份平行测定，以确定样品含量。在其余6份中各精密加入对照品溶液5 mL，按“2.3”项下方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按“2.6”项下回归方程计算。测得平均回收率(n = 6)头孢克洛为97.6%，RSD为0.80%；盐酸溴己新为99.0%，RSD为1.40%。结果见表1。
2.11 样品测定
对3批样品进行测定，按“2.3”项下方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按“2.6”项下回归方程计算供试品的含量。每批样品称2份，每份溶液进样2次。3批样品的含量测定结果见表2。
3 讨论
3.1 供试品溶液制备方法选择
预试时比较了直接溶解和超声等不同的方法，结果超声有利于供试液的制备，对测定结果无显著差异。考察了甲醇和流动相作为溶剂以及不同的超声时间，结果以先用甲醇溶解，超声处理15 min，再用流动相稀释溶解效果最佳。
3.2 色谱条件
分别考察了磷酸二氢钾溶液-乙腈、四丁基氢氧化铵溶液-甲醇两个系统的流动相，结果后者的峰形明显改善，故本实验采用了0.005 mol/L四丁基氢氧化铵溶液(用磷酸调节pH3.2)-甲醇(45∶55)作为流动相。检测波长的选择，主要依据对头孢克洛和盐酸溴己新对照品进行全波长扫描，发现头孢克洛和盐酸溴己新在249 nm处都有吸收，头孢克洛在254 nm的波长处吸收值大于249 nm波长处，线性关系也优于249 nm波长处，说明其在254 nm波长处更稳定，而盐酸溴己新在254 nm的波长处几乎无吸收，因此在254 nm的波长处检测头孢克洛，在249 nm处检测盐酸溴己新。两组分同时检测简化，省时。
[参考文献]
[1] 国家食品药品监督管理局.国家食品药品监督管理局标准(试行)[S].19号.2005.YBH15322005.
[2] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.2010：186-188，799-780 ......
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