RP-HPLC法同时测定双丹口服液中没食子酸、丹参素和原儿茶醛的含量(2)
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2.2.3 阴性溶液的制备 按处方工艺制备不含丹参、牡丹皮的样品，按供试品溶液制备方法制备阴性溶液。
2.3 系统适应性试验
照上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，可见供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，均有相同保留时间的色谱峰，同时3个待测组分没食子酸、丹参素、原儿茶醛色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，阴性样品对测定无干扰，见图1。
A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.没食子酸；2.丹参素；
3.原儿茶醛
图1 双丹口服液液相色谱图
2.4 线性关系考察
分别精密吸取上述混合对照品储备溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用70%甲醇稀释并定容于10 mL容量瓶中。在上述色谱条件下，分别进样20 μL进行测定。结果以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制标准曲线，计算得没食子酸、丹参素、原儿茶醛回归方程分别为：Y = 48 450X-77 657 (r = 0.999 8)、Y = 14 275X-25 376 (r = 0.999 9)、Y = 84 203X-35 716 (r = 0.999 8)。结果表明，没食子酸、丹参素、原儿茶醛分别在5.0～100.0、7.5～150.0、5.0～100.0 μg/mL范围内具有良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取同一浓度混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果没食子酸、丹参素、原儿茶醛的RSD分别为为0.23%、0.50%、0.29%，表明在此试验条件下精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一批供试品溶液(批号：100608)，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样20 μL，测定峰面积。结果没食子酸、丹参素、原儿茶醛的RSD分别为0.62%、1.05%、0.52%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.7 重复性试验
精密称取同一批号供试品(批号：100608)6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定3个成分的峰面积，计算得供试品中没食子酸、丹参素、原儿茶酸含量分别为0.91、2.83、0.46 mg/mL，RSD分别为0.41%、0.21%、0.03%。
2.8 加样回收率试验
精密吸取已测知含量的同一批供试品(批号：100608)6份，每份1.00 mL，精密加入1 mL混合对照品储备溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。没食子酸、丹参素、原儿茶醛加样回收率(n = 6)依次为99.2%、99.8%、100.3%，RSD依次为0.82%、0.94%、0.65%。
2.9 样品含量测定
取批号为090709、100608、100706双丹口服液，按制备供试品溶液方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定3次。见表1。
表1 双丹口服液中没食子酸、丹参素、原儿茶醛含量测定结果
(mg/mL，n = 3)
3 讨论
3.1 流动相的选择
没食子酸、丹参素和原儿茶醛极性均较大，宜采用水相比例较大的流动相，且由于受其结构中酚羟基的影响，都存在测定时易拖尾的现象，流动相中加入适量酸可抑制其拖尾，改善峰形对称性。考察了甲醇-1%冰醋酸水溶液[1]、甲醇-2%冰醋酸水溶液、甲醇-3%冰醋酸水溶液，测定显示采用甲醇-3%冰醋酸水溶液(8∶92，V/V)所得样品峰形好，干扰成分少，保留时间合适，故选此作为流动相。
3.2 色谱柱的选择
根据所选流动相，色谱柱应耐酸并能承受较大水相，试验中曾试用Yilite Hypersil BDS C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱、Yilite Sino Chrom ODS-BP C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱、Phenomenex Luna C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱、Kromasil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm) 色谱柱，最后确定使用Yilite Sino Chrom ODS-BP C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm) 色谱柱。
3.3 其他色谱条件的选择
全波长扫描(210～400 nm)结果显示没食子酸在230、273 nm有最大吸收，丹参素在234、281 nm，原儿茶醛在235、280和312 nm有最大吸收，因在230 nm附近溶剂峰对3个成分色谱峰干扰较大，故选择280 nm为检测波长。考察结果显示，柱温及流速等的改变对含量测定的结果影响不大。
3.4 溶液的制备
考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为溶剂溶解样品对色谱分离情况的影响，结果显示纯甲醇溶解样品会产生溶剂效应，使得色谱峰前延，影响分离效果。综合考虑，以70%甲醇为溶剂，其色谱峰对称性较好，基线也较平稳。
综上所述，本文建立的HPLC法能同时测定双丹口服液中没食子酸、丹参素和原儿茶醛的含量，方法操作简便，省时快捷 ......
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