β防御素-2和白细胞介素-1β在寻常型银屑病患者皮损中表达的研究(2)
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1.3 实验方法
1.3.1 取材及标本处理 皮损区取材：银屑病皮损区切取典型皮损。非皮损区取材：银屑病皮损周围约1 cm处外观正常皮肤切取标本，均于-70℃冰箱内保存。
1.3.2 提取RNA 严格按照TransZol溶液试剂盒说明书进行操作提取RNA，每管样品取5 μL置1 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完毕后用溴化乙锭染色20 min，置紫外灯下观察。紫外分光光度计测吸光度值及计算样品浓度，并保存样品于-70℃备用。
1.3.3 逆转录合成cDNA 反应体系10 μL： 5×PrimeScript■ Buffer 2 μL，PrimeScript■ RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 2 μL [0.5 μg/μ]，RNase Free dH2O 4.5 μL。反应条件： 37℃ 15 min，85℃ 5 s。1.3.4 RT-PCR扩增 取25 μL cDNA进行RT-PCR反应。预变性：95℃ 30 s，1个循环；PCR反应：95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s， 40个循环；72℃延伸7 min，然后4℃ 5 min保存。引物序列： Human-actin上游引物5' AGAGCTACGAGCTGCCTGAC 3'，下游引物5' AGCACTGTGTTGGCGTACAG 3'，产物长度为184 bp。HBD-2上游引物5' ATTCCTGATGCCTCTTCC 3'，下游引物5' GTGCCAATTTGTTTATACCTTC 3'，产物长度为117 bp；IL-1β上游引物5' GGGCCTCAAGGAAAAGAATC 3'，下游引物5' TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA 3'，产物长度为205 bp。反应结束后，得出Ct值，将原始Ct值进行2-△Ct 转换，从而达到线性关系。相对定量的方法即比较Ct值法(2-△△Ct法)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示，多组比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义；组间两两比较采用Bonferroni法，皮损、非皮损和正常对照组两两比较校正检验水准α'= 0.017，P < 0.017为差异有统计学意义；皮损轻、中、重组和正常组两两比较校正检验水准α'= 0.008 3，P < 0.008 3 为差异有统计学意义。指标间相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HBD-2、IL-1β mRNA在寻常型银屑病患者皮损区、非皮损区和正常皮肤表皮中的表达情况
HBD-2、IL-1β mRNA在银屑病皮损组的表达高于正常对照组和银屑病非皮损组，且二者在银屑病非皮损组的表达高于正常对照组，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。见表1。
2.2 HBD-2、IL-1β mRNA在不同等级银屑病皮损组中的表达情况
HBD-2、IL-1β mRNA在轻、中、重度皮损中的表达逐渐升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表2。
2.3 银屑病皮损区HBD-2、IL-1β mRNA的表达与PASI评分的相关性
HBD-2、IL-1β mRNA的表达与PASI评分呈正相关关系(P < 0.05，r = 0.887、0.771)。
2.4 HBD-2、IL-1β mRNA在银屑病皮损区表达的相关性
在银屑病皮损区HBD-2 mRNA与IL-1β mRNA表达呈正相关关系(P < 0.05，r = 0.691)
3 讨论
银屑病是一种免疫异常性慢性炎症增生性皮肤病。人们最初认为， 银屑病原发于人角质形成细胞素紊乱。后来随着研究的深入，银屑病发病机制中目前较为公认的是T细胞介导的免疫机制[3]。IL-1β是重要的细胞因子之一，在银屑病皮损中由活化的T淋巴细胞释放。在银屑病等病理情况下， IL-1β和成熟IL-1β蛋白表达均有增加[4]。刘玮等[5]培养条件下IL-lβ诱导正常人皮肤表达银屑病的免疫病理表型，提示IL-1β参与了银屑病的皮损形成。本研究结果显示，IL-1β在银屑病皮损区表达显著加强，并与PASI评分呈现正相关，再次证实了IL-1β与银屑病皮损的形成有密切关系。
β防御素(HBD)家族是重要的天然免疫效应分子，其中包括HBD-1、HBD-2、HBD-3、HBD-4等[6]。1997年Harder等[7]从银屑病患者病损上皮分离纯化出HBD-2，此后，在包皮、肺、气管、口腔黏膜、皮肤的上皮组织中均发现其表达。除正常组织外，HBD-2主要在感染刺激后的皮肤和黏膜组织中表达[8]，提示HBD-2在宿主抵御微生物感染方面发挥重要作用。既往研究表明，HBD-2为可诱导性防御素，其表达可被许多物质上调，如IL-1β、TNF-α、细菌、真菌、脂多糖等[9-10]。Bajaj-Elliott等[11]研究发现，细胞毒性幽门螺杆菌和IL-1β显著上调胃上皮细胞系AGS和MNK7细胞表达HBD-2。杨琴等[2]用IL-1β干预HaCat细胞后，发现人-防御素2 mRNA的表达增加。常玉英等[12]研究表明，阻断HBD-2后，下调Caco2细胞株对TNF-α和IL-1β mRNA水平的表达，且两者具有时效关系，提示HBD-2可能促进TNF-α和IL-1β的分泌。本研究发现，银屑病时HBD-2与IL-1β均表达增加且随皮损加重而表达增高，并与PASI评分呈现正相关关系，提示IL-1β与HBD-2之间可能存在互相作用而使皮损加重，可能共同参与了银屑病的发病过程，然而具体信号转导通路是如何存在，值得进一步深入研究。
[参考文献]
[1] Bos JD，De Rie MA. The pathogenesis of psoriasis： immunological facts and speculations [J]. Immunol Today，1999，20(1)：40-46.
[2] 杨琴，甄莉.白细胞介素-1β对Hacat细胞诱导产生β防御素-2表达的研究[J].中国药物与临床，2008，8(2)：126-127.
[3] Krueger JG，Bowcock A. Psoriasis pathophysiology： current concepts of pathogenesis [J]. Ann Rheum Dis ......
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