肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6在高血压心肌肥厚大鼠实验中的意义(2)
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术后饲养8周处死大鼠，采取断头取血法，抽取4 mL血样，然后离心分离血清，-20℃保存。测定前先置室温复融，混匀后，利用4℃ 3 000 r/min离心5 min，取上清液，严格按试剂盒说明书进行(分析试剂盒由北京东雅生物技术研究所提供)加样操作。
1.4 RT-PCR法扩增大鼠TNF-α及IL-6基因
1.4.1 引物设计和合成 具体引物由上海申友生物公司合成，包括：β-actin上游引物5-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；β-actin下游引物5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′；TNF-α上游引物5′-TGT TGT AGC AAA CCC TCA AG-3′；TNF-α下游引物5′-AAG TAG ACC TGC CCA GAC T-3′；IL-6上游引物5′-CAC TCA CCT CTT CAG AAC GA-3′；IL-6下游引物5-TGG CAT TTG CAT TTG TGG TTG GGT-3′，以上使用前均稀释成10 μmol/L。
1.4.2 实验操作步骤 取30 mg心肌组织，采用TRIZOL一步法提取组织总RNA，应用RT-PCR法检测大鼠心肌组织中IL-6及TNF-α基因的表达水平。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司，按照说明书进行加样操作。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，以UVP计算机图像扫描分析系统测定电泳条带密度值，以β-actin为内参照，计算TNF-α mRNA及IL-6 mRNA的相对含量，结果以TNF-α、IL-6条带占β-actin条带密度的百分率(%)表示。
1.5 统计学方法
利用SPSS 13.0统计分析软件，经半定量处理后的实验结果以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用配对t检验，确立检验水准α=0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌肥厚大鼠收缩压和心指数的变化
与假手术组比较，心肌肥厚组术后8周动脉收缩压升高(P < 0.05)，心指数明显增加(P < 0.05)。见表1。
表1 心肌肥厚组和假手术组SBP、LVW/BW的变化(x±s，n=10)
注：与假手术组比较，*P < 0.05
2.2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α、IL-6含量变化
腹主动脉部分结扎手术后8周，血清TNF-α、IL-6含量增加，与假手术组比较，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。见表2。
表2 心肌肥厚组和假手术组TNF-α、IL-6血清含量的变化(x±s，n=10)
注：与假手术组比较，*P < 0.05
2.3 心肌肥厚大鼠心肌TNF-α、IL-6 mRNA表达的变化
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，以反应条带在图像分析系统内行吸光度扫描进行半定量分析，IL-6 mRNA及TNF-α mRNA的相对含量用两者条带积分的灰度值与其相应的β-actin的灰度值之比表示。与假手术组比较，心肌肥厚组心肌的IL-6 mRNA及TNF-α mRNA表达增加(P < 0.05)。见表3。
表3 RT-PCR检测两组心肌IL-6及TNF-α mRNA结果(x±s，n = 10)
注：与假手术组比较，*P < 0.05
3 讨论
3.1 成功构建心肌肥厚大鼠模型
心肌肥厚是指心肌细胞体积增大和心肌纤维增生[5]，是心脏对机械牵张和神经体液刺激的一种主要反应[6]。心肌肥大起初是一种对负荷增加或损伤的代偿，但持续性心肌肥大则最终会因心功能失常而导致心力衰竭，因此探讨其机制非常重要。本实验参照Anderson方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型，选取造模8周时进行数据研究。据文献报道[7-9]，造模4周时心肌肥厚模型已经建成，造模8周时模型比较稳定。笔者在前期的实验中分别通过造模4周和8周观察到心肌肥厚组心肌细胞弥漫性肥大，畸形、核大、深染，心肌纤维走行紊乱，间质增生。本实验结果显示心肌肥厚组SBP和LVW/BW显著升高，说明成功制备心肌肥厚大鼠模型。
3.2 心肌肥厚大鼠血清和心肌中TNF-α、IL-6的水平变化及意义
TNF-α是炎性细胞因子之一，其具有多种效应，目前认为TNF-α可以诱导心肌肥厚[10]。TNF-α对心肌的作用复杂多样，可致心肌细胞凋亡[11]，也可引起心肌细胞肥大[12]。TNF对胶原纤维的生成和降解进行双向调节[13-15]。据报道[10-11]在体外培养的乳鼠和成年猫科动物的心肌细胞中，TNF-α可诱导心肌肥大。王桂君等[16]研究结果显示100 μg/L TNF-α能够诱导心肌肥大，表现为蛋白合成、蛋白含量以及细胞体积增大，并增加心肌细胞内Ca2+浓度。IL-6也是一种炎性细胞因子，可致心肌细胞肥大，还有抗凋亡的作用。体外实验中IL-6可直接引起心肌成纤维细胞胶原合成的增加。Flesh等[17]在机械张力刺激的实验中观察到中等程度的拉长心肌细胞时IL-6轻微增加，20 min后TNF-α无变化，60 min后IL-6也不再变化，而在心肌细胞严重拉长时则导致TNF-α、IL-6逐渐增加至较高水平，同时TNF-α、IL-6受体表达也增多。转基因小鼠出现明显的心肌肥厚，条件是在心脏同时过表达IL-6和IL-6受体。综上所述，炎症因子TNF-α、IL-6参与心肌肥厚过程，但这些研究多集中于离体心脏或培养的心肌细胞层面，而炎症细胞因子在疾病过程中对心脏肥大的实际效应以及在体外实验和整体动物中的参与程度和方式会有不同。本实验从整体水平出发，参照Anderson方法制作压力负荷性心肌肥厚大鼠模型，选取TNF-α、IL-6两种炎症细胞因子，观察它们在心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表达变化 ......
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