电针与锌合用对帕金森病模型大鼠一氧化氮\丙二醛等的影响(2)
1 材料与方法
1.1 实验动物
取体重200~250 g成年SD大鼠100 只，雌雄各半，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(合格证：医动字第00018516号)。
1.2 仪器、主要药物与试剂
脑立体定位仪、疲劳转棒仪、HANS LY257 恒流电针仪、台式高速冷冻离心机、执笔式牙科钻(上海江湾医疗器械厂)，XHF-1高速分散器十万分之一电子天平(上海金达生化仪器厂)，日立850 model荧光分光光度计(日本日立公司产)，-70 ℃超低温冰箱，温箱及烤箱，光学显微镜(日本岛津)；6-羟基多巴胺(6-OHDA，美国Sigma 公司)、戊巴比妥钠、阿朴吗啡溶液(5 mg/2mL/kg 体重)，PBS 试剂，DAB，TH抗体，ABC试剂盒，MDA、SOD、NO试剂盒，二甲苯，树脂，硫酸锌等均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法
1.3.1 造模方法与分组
100 只大鼠随机分为假手术对照组(假手术组或Sham组，每组10只)和模型组(9只)。造模方法：将拟造模大鼠以1%戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，常规备皮消毒，切开皮肤，将大鼠颅腹卧位居中固定于大鼠脑立体定位仪上。根据包新民等[7]著大鼠脑立体定向图谱确定右侧黑质定位坐标为：前囟后 3.5 mm ，矢状线右侧旁开 2.5 mm ，硬膜下深 7.5 mm。标记点坐标，用执笔式牙科钻钻透颅骨，牙科探针穿透硬膜。用微量注射器将4 μL(4 μg/μL)6-OHDA(溶于含0.2%抗坏血酸的生理盐水中)注入上述位点各2 μL，缓慢进针，注射速度0.5 μL/min，注射完毕留针10 min后，以1 mm/min 的速度退针，明胶海绵填塞颅骨孔，颅骨表面局部洒少量青霉素粉剂，缝合皮肤，碘酒擦拭缝合处。假手术组立体定位下注射等量生理盐水(内含0.2%维生素C)。术后抗炎3 d。术后2周，给造模大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)，诱导旋转行为，以每分钟旋转不低于7次者为成功模型。造模前后死亡和不合格31只。除①Sham组外，共将合格模型大鼠59只再次随机分为②模型组(MFB组)、③只扎针不通电组(0 Hz组)、④120 Hz电针治疗组(120 Hz组)、⑤120 Hz+锌组和⑥锌组。除了MFB组9只，其余每组均为10只。
, 百拇医药
1.3.2 治疗方法
动物在同等条件下(室温20℃，相对湿度45%)普通饲养。参照华兴邦[8]制订的实验动物穴位图谱，120 Hz组、120 Hz+锌组取百会、命门穴，用13 mm的毫针针刺，接HANSLY 257恒流电针仪，采用连续波，频率为120 Hz，刺激强度以大鼠腿部轻微抽动为度(2~6 mA)。每次30 min，每天1次，2周为1个疗程，疗程间休息1 d，共治疗3个疗程。120 Hz+锌组和锌组的饲料中含小剂量硫酸锌[9](120 mg锌/kg饲粮，即在基础饲料[9](经原子吸收光度计检测，含锌量为20.0 mg/kg)的基础上以硫酸锌的形式(100 mg锌/kg饲粮)添加锌到饲料中，每只大鼠每天的饲粮量按25 g供给。饲粮一次性配好。Sham组和MFB 组不给予治疗。
1.3.3 检测指标及方法
1.3.3.1 各组大鼠行为学检测转棒试验：治疗观察2周后，每隔1周，进行行为学观察。将大鼠放在转棒上，启动转棒，开始计时(由计算机完成)，大鼠为保持平衡而跟随转棒运动，逐渐增加转棒转速，观察大鼠运动，直至大鼠从转棒上掉落，结束计时。从计时开始，到大鼠落地计时结束的时间愈长，大鼠行为学的改善愈好。
, http://www.100md.com
1.3.3.2 各组大鼠右侧黑质丙二醛、一氧化氮含量和超氧化物歧化酶活性测定最后1次行为检测后迅速处死动物，断头取脑，置于冰盘上分离右侧黑质，置于-70℃ 冰箱保存备用。取一半黑质采用手工匀浆法制成100 g/L组织匀浆， MDA、NO含量和SOD活性的测定均按北京中杉金桥试剂盒说明书步骤，用分光光度计检测；另一半用10%的多聚甲醛固定，进行黑质形态学观察。
1.3.3.3 取材、切片，光镜观察黑质TH阳性细胞形态学变化用10%的多聚甲醛固定黑质，石蜡切片，常规脱蜡至水后，TH 免疫组化染色步骤按北京中杉金桥ABC试剂盒的说明进行。在光镜下观察黑质TH阳性细胞的形态和数量并拍片。结果判定：经染色后TH阳性细胞胞浆为棕褐色。
1.4 统计学方法
所有数据应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 行为学测试
MFB组和0 Hz 组与Sham组相比大鼠的运动平衡能力明显减弱(P < 0.05)，说明6-OHDA对MFB组和0 Hz 组的大鼠黑质造成损害从而影响行为学；120 Hz组、锌组和120 Hz+锌组与MFB组相比，在棒上停留时间均明显延长(P < 0.05和P < 0.01)，说明一定频率的电针与锌均对行为学有改善作用，而120 Hz+锌组在前4周对行为学的改善比120 Hz 组、锌组效果更显著。说明电针与小剂量锌合用在明显增强PD模型大鼠的运动平衡能力方面有协同作用。见表1。
2.2 各实验组大鼠黑质超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量测定结果
模型组大鼠黑质SOD活性、NO和MDA含量与Sham组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。120 Hz+锌组的以上指标与模型组相比具有显著性意义(P < 0.01)；120 Hz+锌组与120 Hz组以及锌组相比，以上指标也有统计学意义(P < 0.05)。说明电针和小剂量锌对帕金森病患者体内抗氧化酶系统具有调整作用和协同调整作用。见表2。
, http://www.100md.com
2.3 光镜下各实验组大鼠右侧黑质细胞形态学变化
MFB组和0 Hz组与Sham组比较，黑质TH阳性神经元明显减少，细胞结构不清，核固缩 ，细胞内出现多个空泡呈现细胞早期凋亡的特征；120 Hz组、锌组和120 Hz+锌组与MFB组相比，黑质TH阳性神经元形态学明显改善，细胞数量明显增加，但与Sham组仍有一定的差距，其中120 Hz+锌组的黑质TH阳性神经元形态学改善比MFB组和0 Hz组更加明显(图1~6在湖北省荆州市中心医院病理科完成)。见图1~6。
3 讨论
帕金森病是一种老年病，随着年龄的增高，MDA 的含量增加、SOD 活性下降，体内清除自由基的防御功能日趋衰退，导致自由基增多，过多的自由基可使神经细胞老化和数量大量减少而导致PD的发病[2-3]。本实验造模后，帕金森病大鼠因缺血缺氧，引起细胞膜及细胞器膜发生脂质过氧化，释放大量的自由基，消耗大量的NO，导致SOD活性降低，产生大量的MDA。与模型组比，120 Hz组、锌组以及120 Hz+锌组治疗后，SOD活性明显增强，NO显著增加，MDA明显减少。120 Hz+锌组与120 Hz组、锌组比较，抗氧化作用明显增强(P < 0.05)。SOD能清除多巴胺经氧化代谢产生的H2O2，使多巴胺神经元免受氧化损伤，对机体预防和阻碍PD的发生和发展起到积极的神经保护和治疗作用[2-3]。脑和神经原产生的NO可能参与了中枢神经系统的信息传递，起细胞间信使作用和神经递质作用。脑内NO具有松弛平滑肌、扩张血管、抑制血小板聚集及减轻细胞毒的作用[2，10]。本实验中，120 Hz组、锌组、以及120 Hz+锌组经治疗均能明显改善PD动物的行为，尤以120 Hz+锌组更为明显。电针对PD大鼠黑质细胞通过增加抗氧化酶系统的作用，调动机体自身的各种内在保护机制[2-3，11]。抗氧化微量元素锌参与抗氧化酶的重要构成，同时本身也具有抗氧化功能。锌具有稳定超氧化物歧化酶的结构，锌可与过渡金属离子(Fe2+等)竞争，使H2O2不能转化为毒性更强的羟自由基，减少过氧化脂质(LPO)的生成，增加机体消除自由基的能力，保护生物膜[12]。锌还可通过保护巯基抗氧化和抑制活性氧产生而发挥抗氧化作用[5]。由本实验结果可知，电针以及饲料中加锌后，机体抗氧化酶活性显著增强，且电针与小剂量锌联合应用比各自单独用的效果更好，说明锌在一定程度上可加强电针的抗氧化作用。同时电针和锌均可调节脑内递质，使黑质纹状体内兴奋性和抑制性的两种递质处于平衡状态，从而维持正常运动机能，改善行为学[13-15]。120 Hz+锌组黑质神经元的数量和形态与模型组比有显著改善，大量的坏死细胞和萎缩神经元得到修复，与电针和锌的抗氧化作用密切相关。, 百拇医药(石波 杨蓉 田维珍1 刘海霞 孔德祥 )
1.1 实验动物
取体重200~250 g成年SD大鼠100 只，雌雄各半，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(合格证：医动字第00018516号)。
1.2 仪器、主要药物与试剂
脑立体定位仪、疲劳转棒仪、HANS LY257 恒流电针仪、台式高速冷冻离心机、执笔式牙科钻(上海江湾医疗器械厂)，XHF-1高速分散器十万分之一电子天平(上海金达生化仪器厂)，日立850 model荧光分光光度计(日本日立公司产)，-70 ℃超低温冰箱，温箱及烤箱，光学显微镜(日本岛津)；6-羟基多巴胺(6-OHDA，美国Sigma 公司)、戊巴比妥钠、阿朴吗啡溶液(5 mg/2mL/kg 体重)，PBS 试剂，DAB，TH抗体，ABC试剂盒，MDA、SOD、NO试剂盒，二甲苯，树脂，硫酸锌等均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
, http://www.100md.com
1.3 实验方法
1.3.1 造模方法与分组
100 只大鼠随机分为假手术对照组(假手术组或Sham组，每组10只)和模型组(9只)。造模方法：将拟造模大鼠以1%戊巴比妥钠40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，常规备皮消毒，切开皮肤，将大鼠颅腹卧位居中固定于大鼠脑立体定位仪上。根据包新民等[7]著大鼠脑立体定向图谱确定右侧黑质定位坐标为：前囟后 3.5 mm ，矢状线右侧旁开 2.5 mm ，硬膜下深 7.5 mm。标记点坐标，用执笔式牙科钻钻透颅骨，牙科探针穿透硬膜。用微量注射器将4 μL(4 μg/μL)6-OHDA(溶于含0.2%抗坏血酸的生理盐水中)注入上述位点各2 μL，缓慢进针，注射速度0.5 μL/min，注射完毕留针10 min后，以1 mm/min 的速度退针，明胶海绵填塞颅骨孔，颅骨表面局部洒少量青霉素粉剂，缝合皮肤，碘酒擦拭缝合处。假手术组立体定位下注射等量生理盐水(内含0.2%维生素C)。术后抗炎3 d。术后2周，给造模大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)，诱导旋转行为，以每分钟旋转不低于7次者为成功模型。造模前后死亡和不合格31只。除①Sham组外，共将合格模型大鼠59只再次随机分为②模型组(MFB组)、③只扎针不通电组(0 Hz组)、④120 Hz电针治疗组(120 Hz组)、⑤120 Hz+锌组和⑥锌组。除了MFB组9只，其余每组均为10只。
, 百拇医药
1.3.2 治疗方法
动物在同等条件下(室温20℃，相对湿度45%)普通饲养。参照华兴邦[8]制订的实验动物穴位图谱，120 Hz组、120 Hz+锌组取百会、命门穴，用13 mm的毫针针刺，接HANSLY 257恒流电针仪，采用连续波，频率为120 Hz，刺激强度以大鼠腿部轻微抽动为度(2~6 mA)。每次30 min，每天1次，2周为1个疗程，疗程间休息1 d，共治疗3个疗程。120 Hz+锌组和锌组的饲料中含小剂量硫酸锌[9](120 mg锌/kg饲粮，即在基础饲料[9](经原子吸收光度计检测，含锌量为20.0 mg/kg)的基础上以硫酸锌的形式(100 mg锌/kg饲粮)添加锌到饲料中，每只大鼠每天的饲粮量按25 g供给。饲粮一次性配好。Sham组和MFB 组不给予治疗。
1.3.3 检测指标及方法
1.3.3.1 各组大鼠行为学检测转棒试验：治疗观察2周后，每隔1周，进行行为学观察。将大鼠放在转棒上，启动转棒，开始计时(由计算机完成)，大鼠为保持平衡而跟随转棒运动，逐渐增加转棒转速，观察大鼠运动，直至大鼠从转棒上掉落，结束计时。从计时开始，到大鼠落地计时结束的时间愈长，大鼠行为学的改善愈好。
, http://www.100md.com
1.3.3.2 各组大鼠右侧黑质丙二醛、一氧化氮含量和超氧化物歧化酶活性测定最后1次行为检测后迅速处死动物，断头取脑，置于冰盘上分离右侧黑质，置于-70℃ 冰箱保存备用。取一半黑质采用手工匀浆法制成100 g/L组织匀浆， MDA、NO含量和SOD活性的测定均按北京中杉金桥试剂盒说明书步骤，用分光光度计检测；另一半用10%的多聚甲醛固定，进行黑质形态学观察。
1.3.3.3 取材、切片，光镜观察黑质TH阳性细胞形态学变化用10%的多聚甲醛固定黑质，石蜡切片，常规脱蜡至水后，TH 免疫组化染色步骤按北京中杉金桥ABC试剂盒的说明进行。在光镜下观察黑质TH阳性细胞的形态和数量并拍片。结果判定：经染色后TH阳性细胞胞浆为棕褐色。
1.4 统计学方法
所有数据应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 行为学测试
MFB组和0 Hz 组与Sham组相比大鼠的运动平衡能力明显减弱(P < 0.05)，说明6-OHDA对MFB组和0 Hz 组的大鼠黑质造成损害从而影响行为学；120 Hz组、锌组和120 Hz+锌组与MFB组相比，在棒上停留时间均明显延长(P < 0.05和P < 0.01)，说明一定频率的电针与锌均对行为学有改善作用，而120 Hz+锌组在前4周对行为学的改善比120 Hz 组、锌组效果更显著。说明电针与小剂量锌合用在明显增强PD模型大鼠的运动平衡能力方面有协同作用。见表1。
2.2 各实验组大鼠黑质超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量测定结果
模型组大鼠黑质SOD活性、NO和MDA含量与Sham组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)。120 Hz+锌组的以上指标与模型组相比具有显著性意义(P < 0.01)；120 Hz+锌组与120 Hz组以及锌组相比，以上指标也有统计学意义(P < 0.05)。说明电针和小剂量锌对帕金森病患者体内抗氧化酶系统具有调整作用和协同调整作用。见表2。
, http://www.100md.com
2.3 光镜下各实验组大鼠右侧黑质细胞形态学变化
MFB组和0 Hz组与Sham组比较，黑质TH阳性神经元明显减少，细胞结构不清，核固缩 ，细胞内出现多个空泡呈现细胞早期凋亡的特征；120 Hz组、锌组和120 Hz+锌组与MFB组相比，黑质TH阳性神经元形态学明显改善，细胞数量明显增加，但与Sham组仍有一定的差距，其中120 Hz+锌组的黑质TH阳性神经元形态学改善比MFB组和0 Hz组更加明显(图1~6在湖北省荆州市中心医院病理科完成)。见图1~6。
3 讨论
帕金森病是一种老年病，随着年龄的增高，MDA 的含量增加、SOD 活性下降，体内清除自由基的防御功能日趋衰退，导致自由基增多，过多的自由基可使神经细胞老化和数量大量减少而导致PD的发病[2-3]。本实验造模后，帕金森病大鼠因缺血缺氧，引起细胞膜及细胞器膜发生脂质过氧化，释放大量的自由基，消耗大量的NO，导致SOD活性降低，产生大量的MDA。与模型组比，120 Hz组、锌组以及120 Hz+锌组治疗后，SOD活性明显增强，NO显著增加，MDA明显减少。120 Hz+锌组与120 Hz组、锌组比较，抗氧化作用明显增强(P < 0.05)。SOD能清除多巴胺经氧化代谢产生的H2O2，使多巴胺神经元免受氧化损伤，对机体预防和阻碍PD的发生和发展起到积极的神经保护和治疗作用[2-3]。脑和神经原产生的NO可能参与了中枢神经系统的信息传递，起细胞间信使作用和神经递质作用。脑内NO具有松弛平滑肌、扩张血管、抑制血小板聚集及减轻细胞毒的作用[2，10]。本实验中，120 Hz组、锌组、以及120 Hz+锌组经治疗均能明显改善PD动物的行为，尤以120 Hz+锌组更为明显。电针对PD大鼠黑质细胞通过增加抗氧化酶系统的作用，调动机体自身的各种内在保护机制[2-3，11]。抗氧化微量元素锌参与抗氧化酶的重要构成，同时本身也具有抗氧化功能。锌具有稳定超氧化物歧化酶的结构，锌可与过渡金属离子(Fe2+等)竞争，使H2O2不能转化为毒性更强的羟自由基，减少过氧化脂质(LPO)的生成，增加机体消除自由基的能力，保护生物膜[12]。锌还可通过保护巯基抗氧化和抑制活性氧产生而发挥抗氧化作用[5]。由本实验结果可知，电针以及饲料中加锌后，机体抗氧化酶活性显著增强，且电针与小剂量锌联合应用比各自单独用的效果更好，说明锌在一定程度上可加强电针的抗氧化作用。同时电针和锌均可调节脑内递质，使黑质纹状体内兴奋性和抑制性的两种递质处于平衡状态，从而维持正常运动机能，改善行为学[13-15]。120 Hz+锌组黑质神经元的数量和形态与模型组比有显著改善，大量的坏死细胞和萎缩神经元得到修复，与电针和锌的抗氧化作用密切相关。, 百拇医药(石波 杨蓉 田维珍1 刘海霞 孔德祥 )