瑞香狼毒水提取物对人膀胱癌T24细胞Survivin表达的影响(2)
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参见附件。
1.2.3 细胞凋亡率的检测 将对数生长期的膀胱癌T24细胞消化、计数，种植于6孔板内，每孔1×106个细胞，容积3 mL。待12 h细胞附壁后加入不同浓度药物。实验分为对照组(未加药物的100 μL细胞悬液)，药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设5个复孔，作用48 h后收集细胞，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.4 免疫细胞化学 取对数生长期膀胱癌T24细胞，消化、计数，种植于6 孔板内，每孔1×105个细胞，容积3 mL。12 h细胞附壁后加药干预，实验分为对照组(未加药物的100 μL细胞悬液)，药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)每组设5个复孔，作用48 h后进行免疫细胞化学染色，加入兔抗人Survivin单克隆抗体工作液，4℃温箱孵育过夜，次日滴加二抗(羊抗兔)、显色剂，封片后观察细胞Survivin蛋白的表达。实验以细胞胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性结果，在显微镜下拍照并行灰度值测定。
1.3 统计学方法
应用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，多个样本均数间两两比较采用Bonferroni法检验，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT法检测结果
瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞的生长抑制作用通过MTT法检测不同浓度药物分别处理12、24、48、72 h后，测各组细胞吸光度(表1)及抑制率(表2)，结果显示瑞香狼毒水提取物对该细胞株有明显的生长抑制作用，浓度越高作用，时间越长，抑制作用越明显。
表1 不同浓度瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞作用的OD值(x±s)
注：与对照组比较，★P < 0.05；每个药物浓度组与前一药物浓度组比较，△P < 0.05；每个时间段与前一时间段比较，○P < 0.05
2.2 凋亡率检测结果
药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌T24细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(11.67±2.61)%、(22.40±3.18)%、(38.29±2.30)%、(57.57±3.77)%，各组与对照组凋亡率[(1.05±0.34)%]比较差异有统计学意义(P < 0.05)，高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P < 0.05)。结果显示，随着药物浓度的增高，膀胱癌T24细胞的凋亡率增加。
2.3 免疫细胞化学结果
药物组(0.04、0.2、1、5 g/mL)分别作用于膀胱癌T24细胞48 h后，经过免疫细胞化学染色、封片、显微镜下拍照后，测各组灰度值分别为(142.49±1.67)、(152.14±2.66)、(161.63±4.44)、(171.72±1.17)，各组与对照组灰度值(130.84±4.99)比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，高浓度组与低浓度组比较差异亦有统计学意义(P < 0.05)。结果显示，瑞香狼毒水提取物作用于膀胱癌T24细胞后，下调细胞中Survivn蛋白表达，浓度越高，下调作用愈明显。
3 讨论
瑞香狼毒为瑞香科狼毒属植物，又名红狼毒、棉大戟、断肠草等，为中药狼毒之正品，有毒，用药部位为根，性味苦平，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究发现具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等活性[1]。国外膀胱癌的发病率在男性泌尿生殖肿瘤中仅次于前列腺癌，在我国则占首位。目前，国内外采用综合治疗措施，药物治疗在其中发挥重要作用。国内外学者在瑞香狼毒对肺癌、肝癌、宫颈癌等恶性肿瘤的研究中取得一定成果[2-4]，但对泌尿系统如膀胱癌细胞的抗肿瘤研究少有报道。Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制因子，具有高度保守性和明显抵抗细胞凋亡的作用，参与调控细胞分裂、增殖等过程[5]。Survivin在除胸腺外正常组织中不表达，而在大部分肿瘤细胞中高表达[6]。Survivin基因作为一种凋亡抑制基因在膀胱癌发生、发展过程中起着重要的作用[7-8]，其表达情况与肿瘤的分级、分期密切相关[9-10]，可以作为膀胱癌早期诊断及判断预后的检查指标[11]。本实验研究选择人膀胱癌T24细胞株，给予膀胱癌T24细胞不同浓度瑞香狼毒处理后，观察细胞的抑制率、凋亡率以及Survivin蛋白表达的情况。结果显示：瑞香狼毒水提取物对膀胱癌T24细胞具有明显的抑制作用，具有浓度和时间依赖性。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物促进膀胱癌T24细胞凋亡并下调Survivin蛋白的表达。
综上所述，瑞香狼毒水提取物可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，其作用机制可能与Survivin蛋白表达的下调有关。由于药物促使肿瘤细胞凋亡是通过多条途径共同作用的结果，因此需要进一步深入研究，为开辟膀胱癌临床治疗新途径提供理论依据。
[参考文献]
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[2] Yoshida M，Yokokura H，Hidaka H，et al. Mechanism of antitum or action of PKC activator，gnidimacrin [J]. Int J Cancer，1998，77(2)：243-252.
[3] 冯威健，池川哲郎，吉田光二.瑞香狼毒提取物尼地吗啉的抗癌活性[J].中华肿瘤杂志，1995，17(1)：24-29.
[4] Yoshida M，Feng WJ，Saijo N，et al. Antitum or activity of daphnanetype diterpene gnidimacrin isolated from Stellera chamaejasme L [J]. Int J Cancer，1996，66(2)：268-278.
[5] Ambrosini G，Adida C，Altieri DC. Anovel antiapoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma [J]. Nat Med，1997，3(8)：917-921.
[6] Hoffman WH ......
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