microRNA-34a与非小细胞肺癌的关系及其可能调节机制(2)
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参见附件。
1.2 RNA的提取及RT-PCR法
取50 mg组织标本，加入300 μL生理盐水，匀浆器匀浆后Trizol法提取总RNA(试剂盒购自Invirtogen)，并通过异丙醇沉淀法浓缩提取的RNA，提取结束后采用生物分光光度计测定其纯度和浓度。采用TAKARA公司生产的PrimerScript RT reagent(DRR037A)进行逆转录生成cDNA。U6小核核糖核酸作为内参。采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Foster City， CA)绘制溶解曲线，进行miRNA-34a及c-myc mRNA的相对定量。
1.3 免疫组化法
采用鼠抗人P53单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，应用免疫组织化学SP法进行染色，染色过程中注意控制染色时间及温度，染色时以PBS溶液代替一抗进行平行对照。P53蛋白主要在细胞核表达，胞核中出现棕褐色颗粒说明染色阳性。计算阳性染色率时在10个高倍镜视野中随机选取3个进行阳性率判定，最后取其均值作为P53蛋白表达阳性率的代表，若阳性率高于30%则定义为阳性。c-myc蛋白的免疫组织化学检测原理及方法同P53蛋白(一抗为鼠抗人单克隆抗体)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示，癌组织及癌旁组织miRNA-34a及 c-myc mRNA表达水平比较采用配对t检验； 计数资料用率表示，肺癌组织及癌旁组织P53、c-myc蛋白表达阳性率比较采用χ2检验；miRNA34-a表达水平与P53、c-myc蛋白表达相关性分析采用Spearman秩相关。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺癌组织及癌旁组织的miRNA-34a和c-myc mRNA表达水平比较
肺癌组织miRNA-34a的相对表达量为(1.18±0.25)，癌旁组织为(1.67±0.31)；癌组织c-myc mRNA表达量为(0.39±0.12)，癌旁组织为(0.16±0.09)。非小细胞肺癌组织miRNA-34a及c-myc mRNA的相对表达量高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P < 0.05)，见图1。由图2可知，miRNA34-a与c-myc mRNA表达呈负相关关系，随着miRNA34-a表达量的增加c-myc mRNA表达水平下降(r = -0.80，P < 0.05)。
2.2 肺癌组织及癌旁组织的P53、c-myc蛋白表达水平比较
采用免疫组织化学法染色后，发现在56例肺癌组织标本中有29例P53蛋白呈阳性表达，占51.79%，在癌旁组织中有4例呈阳性表达，表达率为7.14%；不同组织类型P53蛋白的阳性表达率差异有高度统计学意义(P < 0.01)，见表1，图3。癌组织标本中c-myc蛋白阳性表达33例，占58.9%，癌旁组织中阳性表达2例，占3.6%，不同组织类型c-myc蛋白的阳性表达率差异有高度统计学意义(P < 0.01)，见表1、图3。
2.3 miRNA-34a及c-myc mRNA与P53、c-myc蛋白表达的关系
在P53蛋白表达判定为阳性的癌组织和癌旁组织中，miRNA-34a的表达水平为(1.09±0.25)，c-myc mRNA为 (0.45±0.11)；在判定为阴性的癌组织及癌旁组织中miRNA-34a的表达水平为(1.54±0.32)，c-myc mRNA为(0.20±0.11)。见图4。c-myc蛋白表达阳性的肺癌及癌旁组织中miRNA-34a的表达水平为(1.17±0.25)，c-myc mRNA为(0.43±0.12)，在判定为阴性的癌组织及癌旁组织中miRNA-34a的表达水平为(1.48±0.36)，c-myc mRNA为(0.23±0.13)，见图5。
3 讨论
现代医学理论认为，癌症的发生是多因素参与、基因与环境交互作用导致的一种细胞凋亡异常状态。以往对于肺癌遗传易感性的研究多集中在DNA水平，如SNP突变[7](cyp1a1 m1位点的T-C突变)、基因缺失[8](GSTT、GSTM缺失)以及特定基因的甲基化状态(CDH13、p16基因)[9-10]。但是单纯的DNA水平的研究并不能解释完全解释肺癌的遗传易感性。近年来有研究发现，非编码RNA在癌症的发生过程中起到了致癌或抑癌基因的作用，miRNA的作用机制主要是与靶基因的目的mRNA结合从而影响目的基因的转录及翻译水平。miRNA-34a是miRNA-34家族的主要成员之一 ......
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