紫外-可见分光光度法测定普乐安片中总甾醇含量(2)
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参见附件。
2.3 测定条件的选择
2.3.1 测定波长的选择
精密移取0.5 mL β-谷甾醇对照品溶液、1.0 mL供试品溶液于10 mL具塞玻璃管中，85℃水浴挥尽溶剂，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混匀，密塞，70℃水浴保温30 min，取出，流水迅速冷却至室温，精密加入冰醋酸4.6 mL，摇匀，随行试剂作空白，在190～900 nm进行波长扫描，对照品和供试品溶液均在在542 nm有最大吸收峰，故选择542 nm为总甾醇含量测定的检测波长。
2.3.2 显色条件的选择
2.3.2.1 显色反应正交设计 采用四因素三水平L9(34)正交试验优选显色条件，正交因素水平表设计见表1。
精密移取0.5 mL β-谷甾醇对照品溶液于10 mL具塞玻璃试管中，85℃水浴挥尽溶剂，加入不同用量5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混匀，密塞，70℃水浴保温30 min，取出，流水迅速冷却至室温，精密加入不同用量冰醋酸，使溶液体积为6.0 mL，摇匀，随行试剂作空白，在542 nm处测定吸光度值，结果见表2。
由表2可见，直观分析显示各因素对显色反应吸光度的作用主次为A>C>B，最佳显色条件为A3B3C3；方差分析结果表明A因素有统计学意义，而B、C因素无统计学意义；由于显色温度对吸光度无显著影响，考虑供试品稳定性，显色温度70℃为佳。
2.3.2.2 高氯酸用量的选择 参考文献报道，高氯酸用量对显色反应有较大影响，故在已选定的显色条件下，以β-谷甾醇对照品制备供试品溶液，单独考察不同高氯酸用量对显色反应的影响。结果显示，随着高氯酸用量增加，吸光度增加，当用量为1.2 mL时，吸光度出现下降；用量为0.4 mL时，λmax为545 nm，用量为1.0 mL时，λmax为541 nm，可见不同高氯酸用量可引起最大吸收波长及吸光度的变化，考虑对照品和供试品最大吸收波长的一致性以及供试品的稳定性，高氯酸用量以0.8 mL为宜。
综上所述，总甾醇最佳显色条件为：精密移取适量对照品溶液、供试品溶液于10 mL具塞玻璃试管中，85℃水浴挥尽溶剂，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混匀，密塞，70℃水浴保温30 min，取出，流水迅速冷却至室温，精密加入冰醋酸4.6 mL，摇匀，随行试剂作空白，于542 nm测定吸光度。
2.3.2.3 显色稳定性试验 精密移取0.5 mL β-谷甾醇对照品溶液、1.0 mL供试品溶液于10 mL具塞玻璃试管中，自“85℃水浴挥尽溶剂”起，按确定的显色条件进行显色，分别于显色结束10、15、20、25、30 min测定对照品和供试品吸光度变化，结果表明对照品和供试品在30 min内显色稳定。
2.4 总甾醇标准曲线的制备
精密移取0.101 3 mg/mL的β-谷甾醇对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL具塞玻璃试管中，自“85℃水浴挥尽溶剂”起，按确定的显色条件进行显色和测定，以对照品质量和吸收值进行回归计算，得回归方程Y=-0.062 08+11.033 7 X，r = 0.998 8，表明β-谷甾醇在0.030 39～0.081 04 mg线性关系良好。
2.5 供试品溶液稳定性试验
按供试品溶液的制备方法，自“称取本品0.5 g”起制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8 h各精密移取1.0 mL于10 mL具塞玻璃试管中，自“85℃水浴挥尽溶剂”起，按确定的显色条件进行显色和测定，测得不同时间供试品溶液中β-谷甾醇含量见表4，RSD = 2.33%，说明供试品溶液在8 h内稳定。
表4 供试品溶液稳定性试验
2.6 精密度试验
2.6.1 重复性
取普乐安片适量(批号：090220)，按上述含量测定方法制备6份供试品溶液，测得总甾醇的含量分别为2.70%、2.66%、2.64%、2.79%、2.61%、2.70%，平均含量为2.68%，RSD = 2.36%，表明其重复性良好。
2.6.2 中间精密度
取普乐安片适量(批号：090220)，按上述含量测定方法，于数天内测定总甾醇含量，分别为2.64%、2.68%、2.71%、2.71%、2.57%、2.55%，平均含量2.64%，RSD = 2.64%，中间精密度良好。
2.7 加样回收率试验
取普乐安片适量(批号：090220)，按供试品溶液的制备方法，称取6份，每份0.25 g，精密称定，精密加入β-谷甾醇对照品溶液(含β-谷甾醇6.626 mg)，自“精密加入50 mL氯仿”起，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按确定的显色条件进行显色和测定，计算加样回收率，结果见表5，表明本法回收率符合要求。
2.8 普乐安片中总甾醇含量测定
取5批不同批号的普乐安片，按上述含量测定方法测定总甾醇含量，结果分别为2.44%、2.43%、2.49%、2.46%、2.48%。
3 讨论
3.1 样品溶液的皂化处理
样品溶液如果不进行皂化处理直接按显色条件进行显色，其最大吸收峰在537 nm，与对照品最大吸收峰542 nm相差较大，不符合《中国药典》2005年版附录ⅤA[6]紫外-可见分光光度法对供试品溶液吸收峰波长的规定。样品经皂化处理后，吸收峰波长与对照品最大吸收峰波长一致，符合规定，故样品需进行皂化处理。
3.2 显色方法的选择
根据文献报道，选择了Liebermann反应、改良Liebermann-Burchard试剂进行显色反应，但样品、对照品均存在吸光度变化快 ......
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