复方松及片提取物对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响(2)
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参见附件。
1.6 Real time -PCR测定肺组织中磷酸二酯酶8A的mRNA的表达
取液氮固定的左肺组织加入1 mL Trizol于冰浴中匀浆，提取RNA，逆转录合成cDNA，于-20℃保存。以cDNA为模板，用目的基因PDE8引物进行定量PCR扩增，内参为β-actin。引物序列如下：小鼠β-actin上游(5'-3')：GAT TAC TGC TCT GGC TCC TAG C；小鼠β-actin下游(5'-3')：GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG C。扩增条件为：95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，25个循环。小鼠PDE8A上游(5'-3')：CCA TCA CCA AGG TAA TCA；小鼠PDE8A下游(5'-3')：TCC GTG GTG GGA CAT CAT。扩增条件为：95℃ 10 s，48.9℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。
1.7 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺组织纤维化的病理变化的影响
博莱霉素气道滴入后14 d，成功诱导了肺组织纤维化病变。Masson染色呈蓝色的即沉积的胶原纤维。模型组气道附近胶原沉积明显，肺泡组织结构被严重破坏，间隔消失形成空洞。正常组的肺组织肺泡结构清晰且完整，无炎症细胞浸润。而地塞米松组对抗博莱霉素诱导的肺纤维化病变作用不明显。CFRB提取物对此纤维化病变的抑制作用呈现出剂量依赖性，低剂量组效果不明显，高剂量对此纤维化有明显抑制作用。见图1。
2.2 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织羟脯氨酸含量的影响
肺组织中羟脯氨酸含量在博莱霉素气道滴入后14 d即快速上升，与正常组比较差异有高度统计学意义(P < 0.01)。地塞米松组羟脯氨酸含量有抑制趋势，但与模型组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。低、中剂量CFRB提取物对羟脯氨酸的影响也不明显，但高剂量组下降较明显，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.3 CFRB提取物对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠BALF 中TGF-β1含量的影响
在博莱霉素刺激后14 d，TGF-β1上升迅速，达325 pg/mL，明显高于正常对照组(P < 0.001)。而CFRB提取物各剂量对TGF-β1的分泌较均模型组有明显抑制作用，尤以高剂量组为显著(P < 0.001)。而地塞米松组较模型组也能明显抑制TGF-β1的分泌(P < 0.001)。
2.4 CFRB提取物对博莱霉素诱导纤维化肺组织中PDE8A mRNA表达的影响
根据定量PCR结果，博莱霉素刺激后肺组织中PDE8A的mRNA表达量明显增加，这与肺纤维化的趋势相符。与正常组比较，14 d的PDE8A mRNA表达差异有高度统计学意义(P < 0.01)，相对表达量比值为0.49；CFRB提取物各剂量组PDE8A mRNA的相对表达量与模型组比较均有明显下降(P < 0.05或P < 0.01)。地塞米松组PDE8A的表达也有下降，但差异无统计学意义(P > 0.05)。
3 讨论
复方松及片里的成分较多，主要成分白及，具有止血生肌、化痰敛肺的作用。临床多用于大咯血、肺结核少量咯血等的治疗，效果较显著[6-7]。白及水提物中的主成分为白及多糖[8-9]，有研究表明其具有抗菌[10]、抗氧化[11]、抑制大鼠皮肤成纤维细胞VEGF的mRNA表达[12]等作用。中药治疗矽肺的记载中提及白及对矽肺症状有治疗作用，但对X光胸片无改善[2]。沙参具有祛痰作用，有研究报道其对博莱霉素诱导的实验性肺纤维化有明显改善作用[3]，能降低肺组织纤维连接素、层粘蛋白的含量[4]。对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠也有明显改善作用，能降低肺组织羟脯氨酸含量[5]。百部生物碱具有止咳、化痰、平喘、抗菌等作用[13]。Liao等[14]研究发现百部水提取物对Carbacol、组织胺、Kcl所致的离体豚鼠支气管平滑肌痉挛有松弛作用。
磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)是细胞内第二信使cAMP和cGMP的水解酶，负责维持细胞内第二信使浓度平衡，在信号传递过程中扮演着重要作用。PDEs作为一个有11个家族成员的蛋白酶超家族，拥有非常多的变异体。最近的研究表明PDE8家族是保持cAMP稳态的调节者之一，在淋巴细胞中高表达，提示其在调节免疫和炎症中起作用，但目前对其抗炎作用的研究尚无。目前已知哺乳动物PDE8家族包括2个基因PDE8A、PDE8B。两种异构体都对cAMP有特异性且对底物有着很高的亲和力。PDE8A mRNA的表达十分广泛并在许多组织被检测到，PDE8已被证实与淋巴细胞趋化相关，通过干预淋巴细胞内cAMP信号通路可以阻止淋巴细胞透过毛细血管向炎症病灶区聚集。抑制剂实验证明抑制PDE8可以弥补单独抑制PDE4的不足，阻止炎症病灶区对淋巴细胞的募集作用[15]。
博莱霉素诱导的纤维化与IPF的病理生理相似，是目前应用最广泛的肺纤维化模型，用药后14～28 d形成肺纤维化[16]。最近有研究报道PDE亚型抑制剂如PDE4抑制剂-罗氟司特和西洛司特、PDE5抑制剂-西地那非等均对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型有作用[17-19] ......
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