β—细辛醚通过PKA/CREB信号通路对快速老化痴呆小鼠脑组织凋亡机制的影响(1)
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[摘要] 目的 研究β-细辛醚对快速老化痴呆小鼠大脑组织蛋白激酶A(PKA)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的影响。 方法 选取健康昆明小鼠10只作为对照组，30只快速老化小鼠被随机分为模型组(10只)、实验组(10只)、治疗组(10只)。对照组采用生理盐水灌胃，2 mL/次；实验组采用β-细辛醚混浊液灌胃，2 mL/次；治疗组采用脑复康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型组采用生理盐水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持续3周。3周后进行小鼠行为学测试，检测脑组织PKA、CREB酶改变及光镜和电镜下神经元细胞形态变化。 结果 实验组和治疗组与模型组相比，潜伏期明显缩短、在原平台停留时间延长，PKA、CREB 活性与模型组比较均明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)。光镜下观察实验组海马神经元损伤较轻，大部分细胞核清楚完整，电镜下核周隙清晰，细胞器清晰，神经纤维较丰富。 结论 β-细辛醚能提高快速老化痴呆小鼠知识记忆能力，影响PKA/CREB传导路径和突触结构，减少快速老化痴呆小鼠大脑组织神经元损伤，对快速老化痴呆小鼠有明显治疗作用。
[关键词] β-细辛醚；cAMP反应元件结合蛋白；神经元
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(a)-0030-03
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，老年人多发，丧失生活能力，主要是在大脑海马区域出现淀粉样物质，即淀粉样β蛋白(amyloid β protein，Aβ)，Aβ可以使组织产生大量自由基，干扰钙离子代谢，影响炎症反应，从而引起脑神经元发生改变，神经元功能也会发生改变，引起AD发生[1-2]，症状上表现学习和记忆障碍是最早出现的，目前国内外尚无特效药物进行治疗。石菖蒲挥发油是对机体中枢神经系统有保护作用有效成分， 其中β-细辛醚是石菖蒲挥发油的主要成分，β-细辛醚对机体自由基的产生有重要作用，是治疗神经系统的一种药物。β-细辛醚可促进氧自由基代谢，影响大脑学习和记忆能力。本文笔者通过将饲养动物分组后给予β-细辛醚探讨AD发病原因，且观察对老年痴呆小鼠PKA/CREB信号通路的影响作用和快速老化小鼠学习记忆能力影响，分析β-细辛醚药物作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 β-细辛醚购于武汉博士德生物工程有限公司，制成0.1 mg/mL混浊液，每天小鼠灌胃量是2 mL；PKA、CREB一抗、SP试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；DydatechMR4000型酶标仪购自SantaCruz公司，MPIAS-500病理图像分析系统由中国医学科学院药物研究所提供，其他均为国产分析醇试剂。
1.1.2 动物分组 选取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只，均为10个月大小、雄性、体重20～25 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。健康昆明小鼠10只作为对照组，30只快速老化小鼠物随机分为模型组(10只)、实验组(10只)、治疗组(10只)。对照组采用生理盐水灌胃，2 mL/次；实验组采用β-细辛醚混浊液灌胃，2 mL/次；治疗组采用脑复康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型组采用生理盐水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持续3周。
1.2 方法
1.2.1 Morris水迷宫定位航行实验 实验小鼠灌胃3周后进行行为学测试，连续5 d，实验前1 d适应性训练，平台放在第一象限，其他3个象限将其放入水中，每天各测1次，在2 min内尚未找到平台，则将其放平台10 s；若120 s之内找到平台，则其在平台10 s，实验进行5 d。利用上台潜伏期代表实验小鼠的空间学习能力，采用Morrismicrosoft基础类应用程序纪录逃避潜伏期和游泳距离，两次潜伏期算术均值作为这一天成绩进行统计学分析，处理结果。
1.2.2 Morris水迷宫空间探索实验 实验小鼠进行空间探索试验是任选一个入水点将小鼠放入水池中进行试验，记录各组实验小鼠在规定的时间内游泳轨迹，考察各组实验小鼠对原平台记忆，选择任选一相同入水点将各组实验小鼠放入水池中，记录各组实验小鼠在实验进行2 min之内游泳路线，同时记录停留时间，并对其进行实验统计分析，处理结果。
1.2.3 PKA、CREB的测定 实验小鼠乙醚麻醉，断头取出含有海马组织的脑组织，福尔马林固定24 h，PBS洗涤，4℃保存12 h，梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，石蜡包埋，切片组织厚度6 μm，采用海马组织分别测定PKA、CREB，37℃温箱孵育10 min，PBS洗涤，抗原修复10 min，正常羊血清37℃温箱孵育10 min，一抗(PKA、CREB为1 100)37℃温箱孵育1 h，PBS洗涤，二抗IgG-HRP加入后，37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色液显色，PBS洗涤，苏木精染色，脱水，透明，封片，测定部位在海马区，使用病理图像分析系统测定吸光度值，计算阳性细胞数 ......
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