姜黄素对中波紫外线照射HaCaT细胞凋亡的影响(1)
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[摘要] 目的 研究姜黄素对中波紫外线(UVB)照射HaCaT细胞凋亡的影响。 方法 使用MTT法测定不同浓度姜黄素对UVB照射HaCaT细胞增殖的影响；流式细胞仪测定细胞凋亡率；分光光度法检测反映出细胞内caspase-3及caspase-9活性的改变。 结果 UVB照射HaCaT细胞后细胞增殖较未接受UVB照射组明显下降(P < 0.05)，细胞凋亡率可增加5%以上；对姜黄素做预处理后，UVB照射可在一定程度上抑制HaCaT细胞增殖，尤其是当浓度在10.0 μmol/L时，细胞凋亡明显，caspase-3及caspase-9的活性也明显增加。 结论 姜黄素能增强中波紫外线诱导HaCaT细胞的凋亡，这一过程可能是通过激活caspase-3及caspase-9而实现的。
[关键词] 姜黄素；中波紫外线；HaCaT细胞；T细胞凋亡；caspase-3和caspase-9的活性
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(b)-0008-03
姜黄素是一种从姜黄中提取的物质，是姜黄的有效成分。姜黄素已在食用辅料和疾病治疗中有应用，其具有抗炎抗氧化、抑制多种肿瘤生长等作用，有良好的应用前景[1-3]。近年来，与姜黄素相关的研究及应用大多集中在姜黄素的抗肿瘤细胞作用上[4]，但姜黄素对UVB照射的角质形成细胞的作用，国内目前很少有报道。本文通过实验研究，发现了姜黄素在UVB照射HaCaT细胞时，能够促进其凋亡，并分析了其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人角质形成细胞株(HaCaT细胞)购于百奥迈科生物技术有限公司；姜黄素(Sigma公司)；完全培养基由细胞培养基(DMEM)(Gibco公司)、10%小牛血清(四季青公司)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素组成；四甲基偶氮唑蓝(Sigma公司)，乙二胺四乙酸钠(EDTA，上海生工生物工程公司)，噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO，天津市天河化学试剂公司)，caspase-3及caspase-9检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Annexin V-FITC试剂盒(深圳晶美生物有限公司)；UVB紫外照射仪(北京大学光电仪器厂)，超净台、孵育箱(美国Sheldon公司)，倒置相差显微镜(上海长方厂)，DG-3022A型ELISA检测仪(南京华东电子管厂)，流式细胞计数仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.2 方法
1.2.1 药物配制 用少量无水乙醇溶解姜黄素粉(Sigma公司)，配制成5×103 μmol/L浓度的溶液，于-20℃保存。使用时，用培养液稀释，使最终的无水乙醇浓度< 0.1%。
1.2.2 HaCaT细胞的传代培养及种板 人角质形成细胞株HaCaT细胞用完全DMEM培养液(含10%胎牛血清)，置于37.0℃、5%CO2孵育箱中培养，定时更新培养液。估计细胞单层铺满容器底时，PBS洗涤1次，先后加入0.02%EDTA溶液1 mL，0.25%胰蛋白酶溶液1 mL。将培养液放入孵育箱内消化5 min后，在倒置相差显微镜下时，可观察到细胞体外形变圆。当观察到大部分细胞变圆时，加入培养液，终止消化过程。用吸管沿容器壁吹，使贴壁细胞尽可能多地脱离容器壁。置于离心机中，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，再用PBS洗涤1次。加入适量的完全培养液，吸管吹打均匀后，转入培养瓶中继续培养。将培养后的细胞配成单细胞悬液，使用细胞计数板计数后，用培养液将其单细胞悬液稀释10万倍后，接种于培养板，于孵育箱内培养至80%融合度，留存，用于试验。
1.2.3 药物处理及UVB照射细胞 向以上培养板中分别加入浓度0、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L的姜黄素，不同浓度分别设定8个复孔。对培养板中的细胞预处理60 min后，吸弃培养液，并加入少量PBS，后以剂量30 mJ/cm2 UVB照射细胞，更换完全培养液后，继续培养24 h或18 h后，进行以下实验。
1.2.4 检测细胞内的caspase-3及caspase-9活性 细胞继续培养18 h后，吸取部分培养液，使用胰酶消化贴壁细胞，转至新的培养液中。低速4℃离心5 min，去上清。PBS洗涤后，加入裂解液(每200万个细胞加入100 μL裂解液)，轻摇匀使其重悬浮，置冰浴反应15 min。之后放入离心机，4℃ 16 000 r/min离心15 min，取上清至离心管，按说明书加入试剂后混匀，培养约2 h，自培养1 h起开始逐渐缩短时间间隔，观察颜色变化，有明显变化时开始测定样品吸光度。所得数据与空白对照品数据的差，即为样品中的caspase-3和caspase-9催化底物对应产生的吸光度 ......
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