唐古特大黄多糖组分1对小肠上皮细胞辐射损伤的保护作用(1)
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[摘要] 目的 探讨唐古特大黄多糖组分1(RTP1)对电离辐射所致肠上皮细胞损伤的保护作用。 方法 采用大鼠空肠上皮细胞(IEC-6细胞株)，共分为5组，正常对照组(normal control，NC)、辐射对照组(irradiation control，IC)以及RTP1低剂量组(10 μg/mL)、中剂量组(30 μg/mL)和高剂量组(100 μg/mL)，以6.0 Gy 60Coγ射线一次性照射损伤细胞，损伤前用RTP1预处理细胞48 h。采用MTT比色法测定细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡情况并对细胞周期进行检测。 结果 与IC组比较，RTP1可显著提高IEC-6细胞的增殖能力，减少受照射细胞的凋亡和坏死，降低G1期细胞数量，增加S期细胞数量。 结论 RTP1对辐射损伤的肠上皮细胞具有一定的保护作用。
[关键词] 辐射损伤；IEC-6细胞；唐古特大黄多糖；细胞增殖；细胞周期
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(b)-0022-03
＼放射性肠损伤是盆腹腔肿瘤放射治疗时最棘手的并发症之一，且越来越多的证据表明，肠黏膜损伤可进一步加重原发疾病，甚至诱发多脏器功能不全、全身炎症反应综合征，形成恶性循环，甚至危及生命[1]。目前治疗多以对症治疗为主。因此，寻找具有肠黏膜放射损伤预防和治疗作用的物质十分重要。
本实验室采用微滤结合不同截留相对分子量的管式超滤膜串联工艺的方法，从唐古特大黄中分离、提取了5个不同分子量段的大黄多糖(rheum Tanguticum polysaccharide，RTP)，且前期的研究表明，分子量段在6×105～8×105的组分1(RTP1)能够促进肠上皮细胞的增殖、移行和分化[2]，并能够对抗过氧化氢诱导的肠上皮细胞凋亡和坏死[3]，在体内对溃疡性结肠炎小鼠表现良好的治疗作用，同时具有免疫调节功能[4-5]，提示RTP1在肠黏膜损伤修复方面具有一定的作用。本实验拟观察其对电离辐射损伤所致肠上皮细胞的保护作用，为寻找新的、对辐射所致肠黏膜损伤具有防护作用的药物提供依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、试剂与仪器
第三军医大学西南医院烧伤研究所陈健博士提供了本实验所用的正常大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)；唐古特大黄多糖组分1(RTP1)由第四军医大学药理学教研室刘莉博士采用微滤结合不同截留相对分子量的管式超滤膜串联工艺的方法分离得到；培养细胞所用RPMI 1640培养基和超滤胎牛血清分别购自美国Gibco公司和天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；检测细胞增殖的4-甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司，使用前将其用磷酸缓冲液(PBS)配制成5 mg/mL浓度的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤以除去溶液中的细菌，置4℃冰箱避光保存备用。流式细胞仪检测细胞凋亡用的Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodine，PI)凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司产品。
CO2孵箱为美国Nuaice公司产品，倒置荧光显微镜为德国Leica公司产品，酶联免疫检测仪为华东电子管厂产品，流式细胞仪(Coulter XL型)为美国Beckman公司。
1.2 IEC-6细胞的培养
IEC-6细胞培养于RPMI 1640培养液中(含10%超滤胎牛血清、100 mg/L链霉素及1×105 U/L青霉素)，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，2～3 d换液1次，当细胞长至铺满培养瓶底80%时，加入0.25%胰酶溶液消化细胞，进行传代，取对数生长期细胞用于实验。
1.3 RTP1对IEC-6细胞增殖的影响
将细胞分为5组(每组6个复孔)，分别为：①正常对照组(normal control，NC)，②辐射对照组(irradiation control，IC)，③RTP1 10 μg/mL组，④RTP1 30 μg/mL组，⑤RTP1 100 μg/mL组。收集对数生长期细胞，调整细胞密度为1×106/L，以200 μL/孔体积将细胞接种于96孔培养板，培养24 h使细胞贴壁，按照上述分组方式，NC组和IC组各加入100 μL/孔的PBS，给药组亦按照100 μL/孔体积加入不同浓度的RTP1，培养48 h后，除NC组外，各组均以6.0 Gy 60Coγ射线照射，照射距离3 cm，空气比释动能率为3.767 Gy/min。照射后继续培养24 h，采用MTT比色法测定细胞活力。测定时每孔加入20 μL MTT溶液(浓度为5 mg/mL)，继续培养4 h，终止培养，吸取孔内培养液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的测定吸光度(A)值 ......
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