FITC—CSNRDARRC分子探针靶向标记与膀胱移行细胞癌分级相关性的研究(1)
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[摘要] 目的 探讨FITC-CSNRDARRC分子探针靶向标记与膀胱移行细胞癌病理分级的相关性。 方法 采用荧光免疫技术，使用FITC-CSNRDARRC分子探针标记68例膀胱移行细胞癌组织，激光扫描共聚焦显微镜定量检测。 结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱移行细胞癌组织均可见荧光表达，荧光值与肿瘤级别呈正相关(rs=0.942，P < 0.01)，三组差异有统计学意义(P < 0.017)；行各组间两两比较显示，Ⅰ级膀胱癌组与Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌组比较，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，Ⅱ级膀胱癌组与Ⅲ级膀胱癌组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。 结论 FITC-CSNRDARRC分子探针靶向标记与膀胱移形细胞癌病理分级呈正相关，能够区分不同病理级别的膀胱癌。
[关键词] 分子探针；膀胱肿瘤；病理分级
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(b)-0025-02
多肽CSNRDARRC是研究者通过噬菌体展示肽库技术筛选得到的膀胱移行细胞癌靶向性多肽[1-2]。该多肽在组织切片上能够与人类膀胱癌组织靶向结合，其与膀胱癌细胞亦有高度的亲和性[3]。因此认为多肽CSNRDARRC是膀胱癌靶向诊治非常重要的配体肽段，但目前尚未有深入研究该肽段在不同病理级别膀胱癌组织标本中靶向结合状况的报道。笔者设计合成FITC-CSNRDARRC分子探针，用于靶向标记膀胱移行细胞癌组织并检测结合状况，分析其与肿瘤病理分级的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集山西医科大学第一医院2008年1月～2010年12月手术切除保存的膀胱石蜡组织标本68例，其中，男56例，女12例，年龄40～78岁，平均61岁。术后均经病理鉴定为膀胱移行细胞癌，根据病理学检查按WHO分级标准，Ⅰ级22例，Ⅱ级25例，Ⅲ级21例。
1.2 主要试剂与仪器
多肽CSNRDARRC以及FITC-CSNRDARRC分子探针均由上海肽仕生物科技有限公司合成。激光扫描共聚焦显微镜为日本奥林巴斯FV1000型。
1.3 实验方法
1.3.1 切片制备及探针标记 将石蜡组织块在超薄切片机上做1.5 μm薄片，65℃温箱烤片3 h，常规脱蜡至水；3%H2O2室温孵育15 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min；在盛有EDTA(pH 9.0)修复液的高压锅中行高压热修复，维持喷气时间为2 min，自然冷却至室温，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次；5%BSA封闭20 min，倾去残液；暗室内滴加浓度为50 μg/mL的FITC-CSNRDARRC分子探针溶液标记切片，避光4℃过夜；0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，90%甘油封片。
1.3.2 激光扫描共聚焦显微镜定量分析 采用488 nm波长光源激发绿色荧光，在530 nm波长以上观察。每张切片选取荧光表达最强的10个视野扫描观察。由计算机自带分析软件测定荧光强度与面积，荧光值=平均荧光强度×平均荧光面积。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示，组间采用Bonferroni法行两两比较；采用Spearman等级相关进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光图像观察
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱移行细胞癌组织中均可见荧光标记，但膀胱移行细胞癌组织病理级别越高，高亮荧光信号点越多，荧光强度越强。见图1。
2.2 各组荧光值比较
三组膀胱癌平均荧光值差异有统计学意义(P < 0.017)；进而行组间两两比较，Ⅰ级膀胱癌组与Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌组比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)，Ⅱ级膀胱癌组与Ⅲ级膀胱癌组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)，即FITC-CSNRDARRC分子探针在不同病理级别膀胱移形细胞癌间的标记状况存在差异。见表1。
2.3 FITC-CSNRDARRC分子探针荧光值与膀胱癌分级的相关性
FITC-CSNRDARRC分子探针荧光值与膀胱癌级别呈正相关关系(rs= 0.942，P < 0.01)，二者紧密关联，膀胱癌病理级别越高，所检测到的荧光值越大。
3 讨论
膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，它在所有男性以及女性恶性肿瘤中分别占7%和3%[4-5]，具有多中心发病、常伴发原位癌、治疗后易复发等特点。Sylveter等[6]报道膀胱肿瘤手术切除后1年复发率为15%～61%，5年复发率为31%～78%。膀胱肿瘤的筛查、早期诊断及监测复发具有重要意义，发展准确、敏感的膀胱肿瘤早期诊断方法尤为重要。
荧光免疫技术是荧光标记技术和免疫分析技术相结合而产生的一种免疫荧光标记技术，荧光标记的特异性抗原或抗体与样本反应后，可通过荧光显微镜、荧光分光光度计、流式细胞仪及激光共聚焦显微镜等进行定性或定量检测，具有免疫反应的高特异性和荧光标记的高灵敏度的特点。荧光免疫技术可以对多种肿瘤标志物特异性结合并定量、定性检测或同时检测多种肿瘤标志物，越来越广泛地应用于肿瘤等疾病的早期临床诊断及疗效观察上[7]。
本实验从分子水平研究膀胱肿瘤 ......
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