单侧输尿管部分梗阻后输尿管平滑肌细胞中M3受体改变的实验研究(1)
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[摘要] 目的 测定大鼠单侧输尿管部分梗阻(PUUO)后输尿管平滑肌细胞中M3受体mRNA的转录水平和蛋白表达水平改变的规律，以探讨PUUO后输尿管平滑肌细胞中M3受体的作用。 方法 Wistar雄性大鼠80只，随机分为4组：8周PUUO组、16周PUUO组、8周对照组及16周对照组，每组各20只。两PUUO组(n = 40)采用把大鼠输尿管左侧上1/2段埋入腰大肌做成PUUO的大鼠模型，两对照组(n = 40)只游离左侧输尿管。模型制作成功后于8周和16周时取出输尿管，分别用RT-PCR检测输尿管平滑肌M3受体mRNA的含量，Western-blotting检测输尿管平滑肌M3受体蛋白的含量。 结果 RT-PCR结果示：M3受体mRNA的表达8周PUUO组高于8周对照组(55.16±3.94) vs (36.48±3.87)，16周PUUO组低于16周对照组(19.37±3.70)vs(37.39±3.65)，8周PUUO组高于16周PUUO组，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。Western-blotting结果示：M3受体蛋白的表达8周PUUO组高于8周对照组(27.13±1.77)vs(21.36±2.69)，16周PUUO组低于16周对照组(19.41±1.37)vs(23.43±1.58)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，8周对照组与16周对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 梗阻8周时大鼠输尿管平滑肌中M3受体的生物合成上调，梗阻至16周时输尿管平滑肌中M3受体生物合成下调，为后续与临床相结合的研究做了更进一步的铺垫。
[关键词] 单侧输尿管部分梗阻；输尿管平滑肌；M3受体
[中图分类号] R693.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(b)-0034-03
已有研究显示，在单侧输尿管梗阻(PUUO)的动物模型中，8周时PUUO大鼠的输尿管肌条的收缩功能[1]和输尿管平滑肌细胞中的α1-肾上腺素能受体[2]以及Ca2+浓度均强于或者高于同期对照组，而16周时PUUO大鼠的相应指标均是减弱或者降低的。所以本研究采用国内学术界认可的输尿管梗阻动物模型制作方法，于不同实验时间点分离大鼠输尿管检测输尿管平滑肌M3受体蛋白的表达水平，为上尿路动力学研究同临床工作相结合做好铺垫。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组[3-4]
将80只190～230 g雄性Wistar大鼠随机分成4组：8周PUUO组、8周对照组、16周PUUO组和16周对照组，每组各20只。
1.2 大鼠输尿管梗阻模型的建立
两PUUO组大鼠用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后仰卧位固定，腹部备皮后用络合碘消毒左侧腹部，行长3～5 cm的纵形切口。游离左侧输尿管，将腰大肌腹侧纵行切开1～2 cm，将左侧输尿管上1/2包埋于腰大肌切口中，用丝线缝合，注意切口不能过紧，造成部分输尿管梗阻模型。两对照组只将左侧输尿管游离，给与相同的刺激和生理环境。术毕在29℃恒温箱内使动物复苏，复苏后放回笼中，排便后在标准饮食和恒温照明条件下饲养，温度(21±2)℃，湿度(55±2)%[3]。
1.3 肾盂压力检测
参照文献[4]的方法进行模型验证。
1.4 主要试剂与仪器
高保真即用PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，Goat Anti-Mouse IgG(广州康世德生物有限公司)，Western Blotting Kit兔IgG(广州康世德生物有限公司)。PE2400PCR扩增仪(Perkin-Emer公司)，旭日EF-750生物电泳分析系统(广州旭日科技有限公司)。
1.5 实验方法
1.5.1 RT-PCR检测输尿管平滑肌M3受体mRNA表达水平
1.5.1.1 检材取样与RT-PCR 造模成功后，提取输尿管平滑肌细胞M3受体mRNA，取2 μg mRNA加入cDNA合成试剂盒配置成混悬液进行反转录。取总RNA模板2 μg、引物Oligo(dT)18(0.5 μg/μL)1 μL，用Px2′NTase-free水定容至12 μL，充分混合均匀，70℃恒温水浴5 min后加入5×Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor(20 U/μL)1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L)2 μL充分混匀，37℃恒温水浴5 min后加入1 μL M-MuLvRT(20 U/μL)，使终体积为20 μL。37℃水浴保温60 min，70℃水浴加热10 min后结束反应，将所得cDNA于-20℃冻存。各引物序列参照Gen Bank中的序列，应用ABI primer express 3.0软件进行引物设计。
1.5.1.2 PCR扩增反应及电泳 按照高保真即用PCR扩增试剂盒说明书进行PCR扩增反应。抽取每种扩增产物15 μL，进行琼脂糖凝胶电泳分析，分别用DNA marker来判断扩增片段的大小，用溴化乙锭染色来观察所得扩增产物的量与片段大小。PCR扩增产物在100 V恒压1.6%的琼脂糖凝胶中电泳约90 min后，电泳的条带结果输入生物凝胶电泳图像分析系统进行图像分析，根据所得灰度值将参照引物的浓度与M3受体mRNA对比得出具体数值。
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