1，25—(OH)2维生素D3对稽留流产患者蜕膜产生的细胞因子的影响(1)
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[摘要] 目的 研究1，25-(OH)2维生素D3对稽留流产患者蜕膜产生的细胞因子的免疫调节影响。 方法 采用ELISA法检测1，25-(OH)2维生素D3干预前后稽留流产患者及对照组蜕膜基质细胞产生白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、TGF-β的差异。 结果 1，25-(OH)2维生素D3能够下调稽留流产患者和对照组蜕膜细胞产生IL-6、IL-8及对照组产生TGF-β，且促进稽留流产患者TGF-β的产生。 结论 1，25-(OH)2维生素D3能够对稽留流产患者蜕膜产生的细胞因子进行免疫调节，考虑母胎界面免疫调节网络系统的复杂性，维生素D3对稽留流产的治疗作用有待进一步临床验证。
[关键词] 维生素D3；稽留流产；细胞因子
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(b)-0082-03
维生素D的活性成分1，25二羟维生素D3[1，25-(OH)2D3]是一种维持骨代谢及矿物质平衡的脂溶性激素。维生素D3通过与细胞核的维生素D3受体(VDR)结合发挥作用[1]。在人类胎盘和蜕膜存在VDR和各种酶包括维生素D羟化酶，并已经证实局部存在维生素D3复合物均提示这一激素在生殖功能中的重要性[2-4]，越来越多的研究者也发现其作为母胎免疫调节活动中的一个潜在的免疫调节分子的行为[5]。稽留流产发病率近年来呈明显上升趋势，部分患者病因不明，考虑与母胎界面免疫功能异常有关。研究显示，1，25-(OH)2D3抑制树状细胞产生白介素-12(IL-12)，促进其产生IL-10，这些影响使细胞因子模式偏向Th2表型[6-7]。根据最近的研究，子宫内膜和蜕膜产生的细胞因子的模式部分受到子宫内膜与蜕膜前哨树状细胞的控制，其频率和亚型在不同动情周期和妊娠时期受到不同调节[8-9]。因此，本文笔者对维生素D3对不明原因稽留流产患者蜕膜产生的细胞因子是否具有免疫调节作用进行了研究。现将研究结果报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究组选取2010年6月～2011年12月于我院就诊的妊娠12周以内稽留流产患者，符合以下条件：①夫妇双方和(或)胚胎染色体正常，无家族遗传病史；②妇科检查、超声检查和(或)子宫输卵管造影等检查排除患者器质性病变和生殖器官解剖畸形；③月经周期正常，基础体温双相，超声监测排卵正常；④男方精液分析正常；⑤性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查均正常；⑥排除生殖道感染性疾病，如霉菌、支原体、衣原体等感染；⑦巨细胞病毒、弓形虫等病原体检查IgM均为阴性。对照组选取同期妊娠12周以内要求人工流产的正常妊娠妇女，既往无自然流产、死胎、死产史，无遗传、解剖、内分泌方面的异常及感染、自身免疫性疾病史，此次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征；超声证实胚胎发育正常，有心管搏动。术中无菌瓶收集蜕膜，置于盛有100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的冰D-Hanks液中，即刻送至实验室。
1.2 研究方法
FD培养液(F-12/DMEM=1∶1)、胎牛血清(FCS)购自Gibco公司，胰蛋白酶购自上海第二生物制品厂，透明质酸酶、胶原酶购自Sigma公司，PRL 免疫组化试剂盒由博士德公司提供，IL-6、IL-8、转化生长因子β(TGF-β)的ELISA试剂购自BD公司。
选取较厚实的蜕膜组织，在冰D-Hanks液中反复涮洗、吹打清除血污。取小片组织在无菌青霉素小瓶中剪碎使成糊状(1 m3左右)，加入30～50倍体积复合消化酶，充分混匀后置于37℃培养箱中静置消化30 min。取消化上清液置于无菌离心管中，600 r/min离心8 min。清洗两次，弃上清，加入含100 g/L FCS的FD应用液2 mL吹打成细胞悬液。光镜下见组分主要为核直径为25 μm的球形细胞(decidual stroma cell，DSC)，1 g/L的台盼蓝活细胞染色证明细胞存活率达90%。滴板计数并调整细胞浓度至5万～10万/mL，接种于盛有FD应用液(含100g/L FCS)的25 cm2一次性进口培养瓶中，置5%CO2、37℃、湿度99%的培养箱中培养过夜。次日换液，清除污染的红细胞和未贴壁细胞。蜕膜细胞一般2～3 d铺满瓶底，待细胞融合后即可消化传代。取传至第三代的细胞制备细胞爬片，采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶法(SABC法)进行PRL 免疫组化染色，鉴定DSC纯度。
为评估1，25(OH)2D3对蜕膜细胞产生的细胞因子的影响，刺激物种类(IL-1或TNF-α)、1，25-(OH)2D3浓度、用于细胞培养的这些成分的刺激物和作用时间必须优化。简单来说，不同浓度IL-1或TNF-α、不同作用时间首先被检测，基于这些刺激物触发细胞因子产生的能力，选择0.1 μg/L IL-1作用48 h。接下来1，25-(OH)2D3浓度和添加IL-1至1，25-(OH)2D3治疗细胞的间隔时间(同时，6、18 h后)被建立 ......
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