抑癌基因p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响机制研究(2)
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参见附件。
2.3 p14ARF对细胞周期的影响
经流式细胞仪检测，结果显示导入p14基因后，CML-BC1、CML-BC2、CML-BC3、CML-BC4 G0/G1期百分比与对照组相比无显著变化。见图3。
2.4 p14ARF的细胞凋亡诱导效果
应用Annexin V/PI双染色法分析导入p14ARF基因后CML细胞的凋亡细胞百分比，流式细胞术检测结果见图4A。p14ARF感染后的CML-BC1早期凋亡细胞占38%，晚期凋亡细胞占40%，明显高于空载体组早期凋亡细胞3%，晚期凋亡细胞5%，图4B中CML-BC1、CML-BC2、CML-BC3、CML-BC4凋亡细胞比例分别是(78.00±3.37)%、(95.00±0.82)%、(36.00±4.08)%、(69.00±2.58)%，与对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。表明p14ARF基因具有明显地促使慢性粒细胞粒细胞白血病细胞凋亡的作用。
3 讨论
抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中重要的分子事件，很多研究表明，细胞内导入野生型抑癌基因，替代缺失或已突变异常的抑癌基因，可以达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。当前基因治疗已成为肿瘤治疗领域中的一种发展策略。目前体外肿瘤细胞和动物模型基因治疗的进展展示了令人鼓舞的结果，并逐渐从单纯的基础研究过渡到临床应用研究。由于p14ARF基因在细胞周期中的重要调节作用及其与肿瘤发生的密切关系，使其成为基因治疗中不可忽视的候选基因。
p14ARF的作用机制还不清楚，目前认为其通过p53依赖途径和p53非依赖途径发挥抑癌作用。p14可通过p53-MDM2-p14ARF通路行使功能，直接结合MDM2，阻断MDM2诱导p53降解的功能，从而使p53更趋稳定， p53则在细胞中积聚从而发挥细胞周期抑制功能，使细胞周期停滞在G1～S、G2～M期，导致细胞衰老或凋亡[9-10]。p14ARF还能通过非p53依赖性通路直接和细胞内的某些因子如C-myc、Bcl-6等作用，诱导细胞生长抑制和促进凋亡[11]，具体机制尚不清楚。文献报道p14的细胞周期阻断作用依赖肿瘤抑制因子p53。当p53被病毒原癌蛋白中和或p53突变失活时，p14会失去其抑制作用[12]。研究发现在k562细胞内存在p53基因的缺失，另外在慢性粒细胞急性髓细胞变中也多出现p53基因异常，除因基因本身改变而致p53功能丧失外，慢性粒细胞中可能存在p53抑制因子或结合蛋白，致使p53功能丧失[13]。
本次试验中所使用的临床CML细胞可能存在p53基因异常，导致p14ARF对细胞周期调控作用不明显，提示p14ARF对细胞周期调控作用可能主要依赖于p53基因的正常表达，而引起细胞凋亡则主要通过p53非依赖途径。在实验中，笔者所应用的第三代SIN VSV-G假构型慢病毒载体可高效感染CML细胞，明显抑制了CML细胞的生长，诱导白血病细胞凋亡，提示p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞具有明显的抑制作用，也提示p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞的凋亡作用可能主要通过p53非依赖途径。由于本研究样本例数较少，结论有待进一步扩大样本来证实。
[参考文献]
[1] Chen Y，Hu Y，Zhang H，et al. Loss of the Alox5 gene impairs leukemia stem cells and prevents chronic myeloid leukemia [J]. Nat Genet，2009，41(7)：783-792.
[2] Dierks C，Beigi R，Guo GR，et al. Expansion of Bcr-Abl-positive leukemic stem cells is dependent on Hedgehog pathway activation [J]. Cancer Cell，2008，14(3)：238-249.
[3] Stuart SA，Minami Y，Wang JY. The CML stem cell：evolution of the progenitor [J] ......
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