少突胶质前体细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用研究(2)
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参见附件。
1.6 细胞增殖的测定
用甲基噻唑基四唑(MTT)试剂盒检测，严格按试剂盒说明书操作。将细胞按104/孔种植于96孔板，待细胞70%～80%融合时加入不同浓度的MIF，继续培养48 h后，每孔加10 μL MTT试剂，轻轻混合均匀后，将培养板放于37℃孵育3 h，孵育结束后，96孔板底部可见黑色颗粒状物质；轻轻吸掉上层液体，注意不要将黑色颗粒吸出；每孔加入100 μL颗粒溶解液，混匀后成用酶标仪在570 nm处测吸光度值。MIF用5、10、20、40、80 μg/L 5个浓度。
1.7 统计学方法
应用SPSS 11.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 混合胶质细胞培养
细胞培养 4～5 d后开始出现分层现象，下层为星形胶质细胞，细胞胞体大，培养 7～8 d，星形胶质细胞逐渐融汇连成一片，折光性弱；星形胶质细胞上面贴附着一些对称双极或三极突起的细胞，为OPCs或小胶质细胞，它们胞体小，折光性好。
2.2 OPCs的纯化与观察
150 r/min振荡1 h后，显微镜下观察发现，星形胶质细胞表层松散附着的小胶质细胞大量脱落，可见大量呈圆形或梭形，簇状聚集的OPCs，经二次振荡纯化后的OPCs胞体呈小圆形，接种到鸟氨酸处理后培养板上很快开始贴壁。2～3 d后细胞呈卵圆形、梭形或三角形，大多数具有典型的双极突起，部分为三极、多级突起(图2)。
2.3 OPCs的鉴定
纯化的OPCs培养2～3后可做荧光免疫组化鉴定。结果显示，OPCs特异性抗原NG2及PDGFR双抗阳性细胞占细胞总数90%以上。神经元特异性抗原MAP阴性，星形胶质细胞特异性抗原GFAP阳性细胞约占5%(图3)。
2.4 MIF对血管内皮细胞增殖的影响
MTT检测结果用吸光度OD值表示，统计结果显示，低剂量rMIF能显著促进肺少突胶质前体细胞的增殖，并具有剂量相应关系(P < 0.01)，而高剂量rMIF则抑制少突胶质前体细胞的增殖(P < 0.01)。见表1。
3 讨论
OPCs是CNS中的一类干细胞样细胞，它能不断增殖，并最终分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。要弄清楚OPCs的发育、分化以及在CNS中的更多作用及机制，首先需要建立一个简便有效的离体培养方法。近年来，对于大鼠的OPCs的培养方法很多，如密度梯度法、免疫吸附法、神经干细胞定向分化培养法、振荡分离纯化法等[4-5]，但参照这些方法培养小鼠OPCs效果却不理想，并且密度梯度法操作复杂，容易引起细胞死亡，所获得的细胞纯度也低；而免疫吸附法及神经干细胞定向分化培养法的实验仪器要求高，操作过程繁琐，实验成本高。本实验参照国内外新生大鼠的培养方法及Dincman等[6]的新生小鼠OPCs的培养方法，结合实验室的具体条件，采用振荡分离及差速贴壁的纯化方法，按照Dincman等[6]的方法采用添加有N2、PDGF-AA、bFGF的无血清培养基传代培养，结果获得了较高纯度及高密度的少突胶质前体细胞系。国外文献[7-8]报道小鼠OPCs的制备，一般采用免疫磁珠法纯化，这方法纯化OPCs成本比较大，另外由于OPCs在不同发育阶段表达的特异性标志蛋白不一样，使用免疫磁珠法纯化的OPCs数量太少。
本实验采用新生小鼠获得了较高纯度OPCs，分析原因有主要以下几方面：①所有步骤都在冰上操作，保持细胞活性。②在剥除脑膜时，应该在解剖显微镜下操作，保证脑膜及血管等组织完全剥离，这样会减少杂细胞污染。③脑膜剥离干净的脑组织尽量用眼科剪剪碎，否则组织块太大，胰酶不易消化完全，导致细胞产量低。④收集细胞时离心速率不要太高，800 r/min即可，重悬细胞时不要用移液枪反复吹打，否则影响细胞活力。⑤采用无血清培养基非常重要，既可增加OPCs的产量，也可使细胞保持未分化状态[9-10]。如果采用含血清培养基则容易分化成星型胶质细胞，表达GFAP抗原；若不添加任何成分，则细胞基本不生长，不容易存活，并容易分化成少突胶质细胞。本实验所培养细胞从形态上观察是典型的少突胶质前体细胞系；特异性抗体的免疫荧光图片显示其在整个少突胶质细胞膜及突起上均有表达，证实所培养的细胞为少突胶质祖细胞及未成熟少突胶质细胞；细胞纯化率达90%以上。
MIF是T细胞来源的一种可溶性淋巴因子，最初发现它可抑制巨噬细胞的迁移并在炎症局部活化巨噬细胞，并且它可作为垂体激素和免疫调节剂及促炎细胞因子发挥作用。在正常中枢神经系统中，能够表达于星形胶质细胞、室管膜细胞及脉络丛上皮细胞。在大鼠脊髓损伤后，脑脊液中的MIF表达迅速增加；在其他脑部疾病如中风、脑缺血缺氧等损伤过程中，MIF的表达有明显的变化[11-13]，说明MIF在脑损伤及修复过程中起着非常重要的作用 ......
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