杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制的研究(2)
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参见附件。
2 结果
2.1 MTT法细胞死亡率和细胞增殖活力检测结果
杨梅素单体化合物对HepG2细胞有明显的生长抑制作用，通过Bliss法测得杨梅素作用48 h后其IC50值为(32.18±2.31)μmol/L。由结果可知，细胞死亡率随杨梅素单体化合物的浓度的增加而增加。见图1。
2.2 荧光染色后细胞形态变化结果
60 μmol/L的杨梅素溶液作用前，细胞核表面光滑且具有均匀的荧光；而作用24 h后，细胞数目变少且形态变圆，细胞核皱缩和坏死细胞碎片清晰可见，荧光浓染致密，核膜边缘呈现新月状小体，具有典型的细胞凋亡特征，见图2、3。
2.3 杨梅素对HepG2细胞株细胞比率及凋亡率的影响
使用流式细胞仪利用PI染色法观察杨梅素对HepG2细胞株的细胞周期影响，结果表明，不同浓度杨梅素溶液显著影响HepG2肝癌细胞的细胞周期，其作用于HepG2细胞24 h后，与阴性对照组比较，G2/M期细胞比率明显增高，G0/G1期和S期细胞比率降低，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，呈明显的量效依赖关系，其中30 μmol/L杨梅素组G2/M期细胞比率低于50 μmol/L杨梅素组，G0/G1、S期细胞高于50 μmol/L杨梅素组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表1。
2.4 细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p34cdc-2蛋白表达量变化结果
三种不同浓度的杨梅素溶液作用于HepG2细胞24 h后，p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而CyclinB1蛋白的表达量明显上升，且呈现浓度依赖关系。见图4。
2.5 不同浓度的杨梅素溶液对凋亡机制相关蛋白PARP和Bcl-2表达量的影响
不同浓度(0、30、50 μmol/L)的杨梅素溶液作用于肝癌细胞HepG2细胞24 h后，Bcl-2蛋白的表达量锐减，并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白(113 kD)水解为89 kD的特异性水解产物。见图5。
3 讨论
笔者通过多方面的试验数据证实，天然黄酮类化合物杨梅素对肝癌细胞HepG2细胞有生长抑制作用，并呈现良好浓度依赖关系。其中，流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果表明，杨梅素对HepG2肝癌细胞的阻滞在G2/M期。另外，由Western印迹法检测推断，杨梅素通过增加Cyclin B1蛋白的表达量从而使HepG2肝癌细胞无法于分裂后期脱离，进而将其抑制于细胞G2/M期，结果与Annexin V-PI流式凋亡检测结果吻合。而在影响细胞周期的过程中p34cdc-2蛋白的表达量未见显著增加或减少，正是这一结论的佐证。
Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，能特异性裂解天冬氨酸残基，在细胞凋亡信号传到中起着至关重要的作用。根据它在级联反应中的作用可分为线粒体途径和死亡受体途径。前者受线粒体内膜释放的细胞色素C的调控，而细胞色素C受凋亡相关蛋白Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bc1-2，Bc1-XL等的调节，凋亡信号最终导致Caspase-9前体活化成Caspase-9，进一步激活下游的Caspase-3，最后降解底物如PARP，导致细胞凋亡。后者最终引起Caspase-8的活化，再直接作用于Caspase-3，使Caspase-3激活，从而诱导细胞凋亡[7-13]。而图5显示底物PARP降解和抗凋亡蛋白Bcl-2锐减的现象，因此笔者推断杨梅素的诱导HepG2肝癌细胞凋亡可能的作用机制为：参与线粒体途径的调控，通过活化Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白(如Bak、Bax等)使线粒体外膜通透性增加，进而激活Caspase-3，使其底物PARP水解，DNA产生片段化最后完成HepG2细胞凋亡过程。为使其得到进一步的证实，笔者认为接下来的研究可通过引入Caspase-3和Caspase-9抑制剂，尝试干预杨梅素影响线粒体途径的调控，并检测其量效关系。
[参考文献]
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