杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制的研究(1)
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[摘要] 目的 探讨杨梅素对肝癌细胞HepG2的生长抑制和诱导凋亡作用及其作用机制。 方法 应用甲基噻唑蓝(MTT)比色法，测定杨梅素对HepG2细胞株活性的影响，检测其抑制HepG2细胞株的时间效应和剂量效应；应用形态学观察、HE染色和Annexin V-PI流式检测，测定杨梅素对HepG2细胞的凋亡作用，并进行细胞周期的分析，最后对杨梅素对细胞凋亡相关的蛋白p34cdc-2、Cyclin B1、Bcl-2和PARP的影响进行了研究。 结果 杨梅素对HepG2细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用，且呈时间依赖和剂量依赖性，表现为：细胞G2/M期阻滞，出现明显的凋亡峰；Bliss法测定杨梅素对HepG2细胞的IC50值为(32.18±2.31)μmol/L，30、50 μmol/L杨梅素对G2/M期细胞比率分别为(41.32±0.90)%和(80.07±0.90)%，差异有统计学意义(P < 0.05)；p34cdc-2蛋白的表达量未见变化，而CyclinB1蛋白的表达量明显上升，Bcl-2蛋白的表达量锐减，并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白(113 kD)水解为89 kD的特异性水解产物。 结论 杨梅素通过激活Caspase家族蛋白实现对肝癌细胞HepG2细胞株的增殖抑制及诱导凋亡作用。
[关键词] 杨梅素；肝肿瘤细胞；HepG2；凋亡
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(c)-0007-03
[Key words] Myricetin； Liver cancer cell； Cell line HepG2； Apoptosis杨梅素(myricetin，MYR)是从天然植物藤茶(葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物)、杨梅等树皮中提取得到的多羟基黄酮类单体化合物，主要存在于杨梅的树皮中，其中嫩叶茎叶中含量较高，具有显著的生物活性，如抗肿瘤、降低神经毒性、影响淋巴细胞活化和增殖、拮抗血小板活化因子(RAF)、抗氧化抗衰老、保肝退黄以及降血糖等作用[1]。其中，杨梅素在抗肝肿瘤方面的作用日渐备受关注[2-6]。近年来，国内不少学者对其抗肝癌作用机制方面做了大量的总结和研究[5-6]，主要是介绍杨梅素能有效诱导肿瘤细胞的凋亡，然而，由于研究并不深入，未能从分子生物水平上阐释杨梅素的抗肿瘤机制。本文通过甲基噻唑蓝(MTT)法对细胞增殖活力进行检测、倒置相差光学显微镜下观察荧光染色细胞生长形态、Annexin V-PI流式检测HepG2的细胞生长周期以及进一步的DNA片段电泳等实验，表明杨梅素通过影响肿瘤细胞HepG2的生长周期诱导细胞凋亡从而发挥其抗肝癌作用，并深入揭示起作用机制与激活Caspase家族蛋白直接相关。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 Olimpus CKX41临床型倒置显微镜，德国MACSQuantTM流式细胞仪，上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-IⅡ型CO2细胞培养箱。
1.1.2 试剂及耗材 人类肝癌细胞HepG2(购于广州市中山医科大学病理科)，小牛血清(购于广州蕊特生物科技有限公司)，杨梅素(由广州市中山大学药学院制备并提供，HPLC纯度高于95%)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(包括Caspase-3和Caspase-9)以及DNA引物试剂(均购于美国CST生物工程有限公司)，RPMI1640和DMEM培养基(购于上海阳光生物技术有限公司)，96孔培养板(购于广州市华粤行有限公司)。溴化乙锭、磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)、二甲亚砜(DMSO)、琼脂糖、MTT等其他试剂，均为分析纯，购于广州化学试剂厂。
1.2 方法
1.2.1 杨梅素溶液的制备 取杨梅素纯品适量，精密称定，用0.1%DMSO溶液溶解并稀释至杨梅素浓度为100 μmol/L；临用时DMEM培养液稀释。
1.2.2 MTT法检测细胞死亡率和细胞增殖活力 以7 000/孔的密度接种于96孔板，每孔180 μL，培养过夜，静置，分别加入10 μL由0～60 μmol/L不同浓度的杨梅素单体化合物溶液，并设置阴性对照组。药物作用48 h后培养结束前4 h加入MTT，继续培养4 h后倾去培养液，加入DMSO 100 μL使溶解、显色，用酶联仪以570/630双波长测定，以杨梅素浓度(μmol/L)为横坐标，细胞死亡率(%)为纵坐标，绘制杨梅素对HepG2细胞增殖影响的曲线图，并利用Bliss法算出细胞抑制生长率达50%时的杨梅素的药物浓度，以IC50值表示。
1.2.3 荧光染色细胞形态观察 从MTT法检测细胞死亡率的结果中，选定一定浓度的杨梅素单体化合物溶液。以100 000个/孔的细胞密度接种于6孔板(具有玻片)中，培养24 h后，加入选定浓度的杨梅素溶液，作用不同时间(分别为即刻和24 h) ......
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