疏肝通络强精方对改进型实验性精索静脉曲张大鼠睾丸EGF、TGF—β1表达的影响(1)
1.南昌市医学科学研究所附属医院 南昌市男科医院，江西南昌 330001；2.浙江省绍兴市中医院，浙江绍兴 312000；
3.浙江中医药大学附属宁波市中医院，浙江宁波 315010
[摘要] 目的 从分子水平探讨疏肝通络强精方治疗精索静脉曲张致不育的作用机制。 方法 选择青春期清洁级雄性SD大鼠50只，按随机数字表法分为假手术组、模型组、手术治疗组、桃红四物合五子衍宗汤组(桃红合五子组)、疏肝通络强精方组，每组各10只。1个月后，对各组均按1 mL/100 g体重灌胃，给药或生理盐水，每日1次，普食喂养，自由饮食饮水，连续60 d后，处死并取出睾丸，免疫组化法检测睾丸组织转化生长因子(TGF-β1)及表皮生长因子(EGF)的表达。 结果 ①模型组睾丸组织EGF表达量较各治疗组明显减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。②模型组睾丸组织TGF-β1表达量较各治疗组明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。 结论 实验性精索静脉曲张青春期大鼠睾丸局部生长因子EGF、TGF-β1的变化是影响生精功能并导致精子质量下降的可能机制之一；疏肝通络强精方能明显下调TGF-β1表达，并能上调EGF的表达，从而提高精液质量，可能是疏肝通络强精方对改进型实验性精索静脉曲张青春期大鼠睾丸生精功能保护作用的调控机制之一。
, 百拇医药
[关键词] 精索静脉曲张；疏肝通络强精方；不育；EGF；TGF-β1；动物模型；睾丸
[中图分类号] R697.24 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(c)-0012-04
现代医学认为，男性不育受多个环节因素的影响，其中精索静脉曲张在明确病因中占有很大比重。WHO已把精索静脉曲张列为男性不育的首要原因。动物实验表明[1]，疏肝通络强精方能不同程度减轻精索静脉曲张对睾丸组织形态学影响，并可减少生精细胞的凋亡，并能上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达[2]及下调Caspase-3、Hsp60表达[3]，对精索静脉曲张引起的睾丸病理损伤有保护作用。为进一步从分子水平探讨疏肝通络强精方治疗精索静脉曲张致不育的作用机制，笔者进行了疏肝通络强精方对改进型实验性精索静脉曲张不育青春期大鼠睾丸表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β1)影响的研究。现报道如下：
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级青春期雄性SD大鼠50只(5～6周龄)，体重180～200 g。实验前1周在浙江中医药大学清洁级动物实验中心标准实验房(22℃)适应性分笼饲养。
1.2 实验试剂
1.2.1 试剂
PBS磷酸盐缓冲液(ZLI-9062)，浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032)(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)；TGF-β1与EGF单克隆抗体(美国Lab Vision-Neo Markers)；免疫组化检测试剂盒(美国DAKO公司)。
1.2.2 药物组成
1.2.2.1 疏肝通络强精方 红花6 g、丹参30 g、三七粉3 g；菟丝子10 g、枸杞子10 g、五加皮10 g、炒露蜂房10 g、柴胡10 g、煅牡蛎30 g、煅龙骨30 g，以上为成人1 d剂量。
, http://www.100md.com
1.2.2.2 桃红四物合五子衍宗汤 红花6 g、桃仁10 g、熟地20 g、川芎10 g、当归15 g、赤芍15 g、五味子10 g、枸杞子12 g、覆盆子12 g、菟丝子20 g、车前子12 g，以上为成人1 d剂量。
1.2.3 药物的制备
将上述两组药物分别放入煎煮锅内，各加10倍量的水，逐渐加火力至水沸腾(水量被蒸发减少时，适当加量)，用文火再慢慢煎煮1 h，倾出煎液过滤，残渣加水继续煎3次，直至煎液味变淡时，合并全部煎液后过滤，再将过滤液置浓缩锅内，加热沸腾后，不断撇去浮沫，浓煎至2.4 g/mL(含生药量)，灭菌后放置4℃冰箱备用。
1.3 实验方法
1.3.1 动物选择与分组
取清洁级青春期雄性SD大鼠50只，称重后随机编号、分组，即假手术组、改进型左侧精索静脉曲张组(模型组)、手术治疗组、疏肝通络强精方组、桃红四物合五子衍宗汤组(桃红合五子组)，每组各10只。
, 百拇医药
1.3.2 模型建立
造模前实验大鼠自由饮水、饮食1周，观察无异常即可进行造模。造模方法参照俞建军等[4]法。
1.3.3 给药方法
假手术组与模型组：术后1个月，予以生理盐水，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；疏肝通络强精方组：术后1个月，予以疏肝通络强精方水煎浓缩剂含生药2.4 g/mL，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；桃红合五子组：术后1个月，予以桃红合五子水煎剂含生药2.4 g/mL，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；手术治疗组：于造模后30 d采用精索静脉结扎术将精索静脉结扎，术后以生理盐水按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水。以上各组按实验方法灌注中药或生理盐水，每日1次，连续60 d。
1.3.4 标本制备
, 百拇医药
给药60 d后，实验大鼠乙醚吸入麻醉，切开阴囊皮肤，暴露双侧睾丸，冷生理盐水冲洗血液，剔除被膜血管，滤纸滤干，电子天平称重后，置入10%中性缓冲福尔马林(pH 7.4)溶液固定24 h，梯度酒精脱水，浸蜡、包埋备检。
1.3.5 检测方法
免疫组化法(两步法)检测EGF、TGF-β1水平，方法按照试剂盒说明书操作步骤进行。
1.3.6 图像分析
图像分析：显微镜下对切片拍摄照片，并进行图像分析；光源亮度：恒定电压5.5 V(显微镜卤素灯，电压可调0～12 V区间)；放大倍数：400倍；物镜×40；自动白平衡：关；曝光时间：1/90 s；图像分辨率：960×1 280；图像尺寸：72 041.227 μm2；Area：图像分析所得面积，软件输出以像素为单位；实际面积＝Area×72 041.227/1 228 800 μm2；平均吸光度(mean density)：阳性表达区域的吸光度平均值，反映表达部位的阳性强度；总吸光度(IOD)：∑Area(阳性表达部位)×Density(该部位的平均吸光度)，表示照片内所有阳性表达部位的Area×Density的和；阳性指数：表示总吸光度均分到该照片的值，IOD/72 041.227(IOD面积以实际尺寸μm2单位计算)。
, http://www.100md.com(姚文亮 张端军 陈胜辉 黄奉献 崔云)
3.浙江中医药大学附属宁波市中医院，浙江宁波 315010
[摘要] 目的 从分子水平探讨疏肝通络强精方治疗精索静脉曲张致不育的作用机制。 方法 选择青春期清洁级雄性SD大鼠50只，按随机数字表法分为假手术组、模型组、手术治疗组、桃红四物合五子衍宗汤组(桃红合五子组)、疏肝通络强精方组，每组各10只。1个月后，对各组均按1 mL/100 g体重灌胃，给药或生理盐水，每日1次，普食喂养，自由饮食饮水，连续60 d后，处死并取出睾丸，免疫组化法检测睾丸组织转化生长因子(TGF-β1)及表皮生长因子(EGF)的表达。 结果 ①模型组睾丸组织EGF表达量较各治疗组明显减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。②模型组睾丸组织TGF-β1表达量较各治疗组明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。 结论 实验性精索静脉曲张青春期大鼠睾丸局部生长因子EGF、TGF-β1的变化是影响生精功能并导致精子质量下降的可能机制之一；疏肝通络强精方能明显下调TGF-β1表达，并能上调EGF的表达，从而提高精液质量，可能是疏肝通络强精方对改进型实验性精索静脉曲张青春期大鼠睾丸生精功能保护作用的调控机制之一。
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[关键词] 精索静脉曲张；疏肝通络强精方；不育；EGF；TGF-β1；动物模型；睾丸
[中图分类号] R697.24 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(c)-0012-04
现代医学认为，男性不育受多个环节因素的影响，其中精索静脉曲张在明确病因中占有很大比重。WHO已把精索静脉曲张列为男性不育的首要原因。动物实验表明[1]，疏肝通络强精方能不同程度减轻精索静脉曲张对睾丸组织形态学影响，并可减少生精细胞的凋亡，并能上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达[2]及下调Caspase-3、Hsp60表达[3]，对精索静脉曲张引起的睾丸病理损伤有保护作用。为进一步从分子水平探讨疏肝通络强精方治疗精索静脉曲张致不育的作用机制，笔者进行了疏肝通络强精方对改进型实验性精索静脉曲张不育青春期大鼠睾丸表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-β1)影响的研究。现报道如下：
, 百拇医药 1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级青春期雄性SD大鼠50只(5～6周龄)，体重180～200 g。实验前1周在浙江中医药大学清洁级动物实验中心标准实验房(22℃)适应性分笼饲养。
1.2 实验试剂
1.2.1 试剂
PBS磷酸盐缓冲液(ZLI-9062)，浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032)(北京中杉金桥生物技术有限公司产品)；TGF-β1与EGF单克隆抗体(美国Lab Vision-Neo Markers)；免疫组化检测试剂盒(美国DAKO公司)。
1.2.2 药物组成
1.2.2.1 疏肝通络强精方 红花6 g、丹参30 g、三七粉3 g；菟丝子10 g、枸杞子10 g、五加皮10 g、炒露蜂房10 g、柴胡10 g、煅牡蛎30 g、煅龙骨30 g，以上为成人1 d剂量。
, http://www.100md.com
1.2.2.2 桃红四物合五子衍宗汤 红花6 g、桃仁10 g、熟地20 g、川芎10 g、当归15 g、赤芍15 g、五味子10 g、枸杞子12 g、覆盆子12 g、菟丝子20 g、车前子12 g，以上为成人1 d剂量。
1.2.3 药物的制备
将上述两组药物分别放入煎煮锅内，各加10倍量的水，逐渐加火力至水沸腾(水量被蒸发减少时，适当加量)，用文火再慢慢煎煮1 h，倾出煎液过滤，残渣加水继续煎3次，直至煎液味变淡时，合并全部煎液后过滤，再将过滤液置浓缩锅内，加热沸腾后，不断撇去浮沫，浓煎至2.4 g/mL(含生药量)，灭菌后放置4℃冰箱备用。
1.3 实验方法
1.3.1 动物选择与分组
取清洁级青春期雄性SD大鼠50只，称重后随机编号、分组，即假手术组、改进型左侧精索静脉曲张组(模型组)、手术治疗组、疏肝通络强精方组、桃红四物合五子衍宗汤组(桃红合五子组)，每组各10只。
, 百拇医药
1.3.2 模型建立
造模前实验大鼠自由饮水、饮食1周，观察无异常即可进行造模。造模方法参照俞建军等[4]法。
1.3.3 给药方法
假手术组与模型组：术后1个月，予以生理盐水，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；疏肝通络强精方组：术后1个月，予以疏肝通络强精方水煎浓缩剂含生药2.4 g/mL，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；桃红合五子组：术后1个月，予以桃红合五子水煎剂含生药2.4 g/mL，按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水；手术治疗组：于造模后30 d采用精索静脉结扎术将精索静脉结扎，术后以生理盐水按1 mL/100 g体重灌胃，普食喂养，自由饮食饮水。以上各组按实验方法灌注中药或生理盐水，每日1次，连续60 d。
1.3.4 标本制备
, 百拇医药
给药60 d后，实验大鼠乙醚吸入麻醉，切开阴囊皮肤，暴露双侧睾丸，冷生理盐水冲洗血液，剔除被膜血管，滤纸滤干，电子天平称重后，置入10%中性缓冲福尔马林(pH 7.4)溶液固定24 h，梯度酒精脱水，浸蜡、包埋备检。
1.3.5 检测方法
免疫组化法(两步法)检测EGF、TGF-β1水平，方法按照试剂盒说明书操作步骤进行。
1.3.6 图像分析
图像分析：显微镜下对切片拍摄照片，并进行图像分析；光源亮度：恒定电压5.5 V(显微镜卤素灯，电压可调0～12 V区间)；放大倍数：400倍；物镜×40；自动白平衡：关；曝光时间：1/90 s；图像分辨率：960×1 280；图像尺寸：72 041.227 μm2；Area：图像分析所得面积，软件输出以像素为单位；实际面积＝Area×72 041.227/1 228 800 μm2；平均吸光度(mean density)：阳性表达区域的吸光度平均值，反映表达部位的阳性强度；总吸光度(IOD)：∑Area(阳性表达部位)×Density(该部位的平均吸光度)，表示照片内所有阳性表达部位的Area×Density的和；阳性指数：表示总吸光度均分到该照片的值，IOD/72 041.227(IOD面积以实际尺寸μm2单位计算)。
, http://www.100md.com(姚文亮 张端军 陈胜辉 黄奉献 崔云)