N—乙酰半胱氨酸对肺微血管内皮细胞核因子κB活性影响的体外研究(2)
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参见附件。
1.2.4 免疫蛋白质印迹(Western blot)检测HPMEC胞质内IκBα表达 取上述提取的30 μg胞质蛋白以12% SAD-PAGE凝胶电泳分离，电泳时间约90 min。然后进行电转移蛋白至PVDF膜150 min，4℃下含5%脱脂奶粉的TBS-T液封闭过夜，加入Ⅰ抗IκBα多抗(1∶200)于4℃下封闭袋中孵育2 h；Ⅱ抗(1∶4 000辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体)室温孵育1 h。在暗室中采用化学发光增强反应法显示结果，X线压片曝光。经凝胶图象分析系统(英国UVP公司)分析HPMEC胞质内蛋白质印迹条带的灰度。
1.2.5 免疫细胞化学检测HPMEC NF-κB表达的核转移 制备HPMEC细胞爬片，分别予以TNF-α(100 ng/mL)处理1 h；NAC(1 mmol/L)和TNF-α(100 ng/mL)联合处理1 h(NAC预处理1 h后再予TNFα刺激1 h)。设定未予NAC及TNF-α处理且继续在含10%小牛血清DMEM培养基中生长的HPMEC为正常对照组。免疫细胞化学检测HPMEC NF-κB的表达，NF-κB多抗(1∶200)，DAB显色。以小鼠血清替代Ⅰ抗作为阴性对照。阳性信号为细胞质或细胞核呈棕黄色。
1.2.6 激光扫描共聚焦显微镜观察HPMEC中COX-2的表达 取呈对数生长期HPMEC制备成细胞悬液，接种于6孔培养板的盖玻片上，制作成细胞爬片，予TNF-α(100 ng/mL)处理24 h；NAC(1 mmol/L)和TNF-α(100 ng/mL)联合处理24 h。PBS漂洗，洗去血清，4℃下4%多聚甲醛固定15 min，经封闭液封闭后行免疫荧光染色。Ⅰ抗为鼠抗人COX-2(1∶200)，4℃下孵育过夜；荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记兔抗鼠Ⅱ抗(1∶200)4℃孵育1～2 h，避光PBS漂洗，在室温下封片避光保存并保持平整。将6孔培养板置于激光扫描共聚焦显微镜载物台，其激发波长为488 nm，发射波长为526 nm，标定视野并扫描，进行荧光素抗体标记的图像采集、储存、合并和分析信息，得出HPMEC平均FITC荧光值及标准差。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 11.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用
MTT结果显示NAC处理组吸光度值明显低于正常对照组和TNF-α处理组，NAC+TNF-α联合处理组吸光度值明显低于TNF-α处理组，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，提示NAC对HPMEC的增殖活化有显著抑制作用。见表1。
2.2 NAC对HPMEC NF-κB结合活性的影响
EMSA结果显示，TNF-α刺激后具有诱导NF-κB结合活性，而通过NAC干预后能显著抑制TNF-α所诱导的NF-κB结合活性，其灰度值为TNF-α处理组的2/3。见图1。
2.3 NAC对HPMEC IκBα表达的影响
Western Blot检测后经凝胶图象分析系统显示胞质内蛋白质印迹条带的灰度结果显示，NAC处理组为(0.92±0.07)，TNF-α处理组为(0.21±0.04)。NAC处理组IκB-α表达高于TNF-α处理组，差异有高度统计学意义(P < 0.01)；NAC处理组IκB-α表达与正常对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)，提示TNF-α刺激后IκBα表达明显减弱，而经NAC处理后HPMEC IκB-α表达明显增强。见图2。
A：正常对照组；B：NAC处理组；C：TNF-α处理组
图2 免疫蛋白质印迹检测N-乙酰半胱氨酸和肿瘤坏死因子α对人肺微血管内皮细胞核因子κB抑制蛋白表达的影响
2.4 NAC对HPMEC NF-κB表达的核转移
免疫细胞化学检测结果显示，正常对照组HPMEC细胞质为棕黄色，提示NF-κB表达位于细胞质；TNF-α刺激1 h后，HPMEC棕黄色主要显示在细胞核，提示NF-κB表达从细胞质转移至细胞核内，而NAC预处理后再予TNF-α刺激，HPMEC主要为细胞质棕黄色，提示NF-κB表达主要位于细胞质，出现核内转移极少，因此NAC具有降低了NF-κB进入细胞核的活性，从而发挥积极的抗炎作用。
2.5 NAC对HPMEC COX-2表达的影响
激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示，经TNF-α刺激后HPMEC细胞内平均荧光值(936.21±60.39)明显高于NAC+TNF-α联合处理组(665.71±49.13)和正常对照组(605.17±44.76)，差异均有统计学意义(均P < 0.05)；NAC+TNF-α联合处理组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。
3 讨论
研究表明，脓毒症的发生发展是由于病原体及其代谢产物诱导活化的血管内皮细胞、免疫细胞和炎症细胞等引起免疫应答，其中通过NF-κB途径，产生大量的炎症因子和炎症介质，导致炎症放大、免疫调理紊乱等病理生理过程。氧自由基可能与脓毒症的发生、发展密切相关，NAC作为一种含活性巯基供给体，具有抗氧化损伤、抗炎、调节细胞代谢、预防组织细胞损伤、调节基因表达等作用，近年来其在脓毒症防治方面作用也日益受到重视[6-7]。因此，将在脓毒症发生发展中起着重要作用的微血管内皮细胞作为靶点，探讨抗氧化剂对其的影响机制具有重要的意义。
NAC是一种合成的细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽的前体，广泛分布于肺、肝、肾上腺、脾、心肌和脑等组织，它是一种小分子物质，易进入细胞，透过细胞膜并在细胞内脱去乙酰基，形成L-半胱氨酸，增加细胞内巯基类化合物水平，具备抗氧化和硫醇-二硫化物交换作用，发挥抗氧化、抗毒素损伤、抗炎、调节细胞代谢等能力，因而在脓毒症的防治中倍受重视。NAC可抑制脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤和肝损伤，可抑制大鼠炎症放大，降低多种炎症介质(IL-6、IL-8等)的释放，及向脓毒症、多器官功能障碍综合征发展[8-9]。此外，血管内皮细胞富含一氧化氮合酶，这样NAC可通过恢复损伤细胞内的内皮型一氧化氮合酶，从而减弱血管内皮细胞的损伤；通过抑制诱导型一氧化氮合酶的表达，减少炎症介质的释放；通过与NO反应生产亚硝基硫醇，后者作为NO分子的载体促进收缩的微循环血管扩张 ......
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