急性肺损伤大鼠前爪对应部位血EB含量变化研究(1)
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[摘要] 目的 研究肺损伤前后大鼠前爪特定区域内血液中伊文思蓝(Evans blue，EB)含量的变化数据，通过数据的变化，研究肺与前爪特定区域的对应关系，为通过手部可以诊断西医疾病的手诊提供动物模拟实验依据。 方法 20只雄性SD大白鼠按随机数字表法分为模型组(10只)、对照组(10只)，模型组大鼠腹腔注射内毒素复制急性肺损伤模型，6 h后两组均从尾静脉注射2.5% EB生理盐水溶液，然后测量手掌各个特定不同区域内EB的吸光度(A)值大小，根据A值大小的变化，间接地了解各区域内前爪特定部位左右两侧血液中EB含量的变化情况。 结果 对照组大鼠左右同一部位A值比较无明显差异，内毒素型肺损伤大鼠3区的A值左右之间比较，差异有统计学意义(P = 0.018)。 结论 在急性肺损伤的状态下，前爪与内脏之间应该存在着特定的相关性联系。
[关键词] 内毒素型肺损伤；手掌特定部位；血含量；研究
[中图分类号] R563.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)01(c)-0021-03
“司外揣内”是中医学的基本理论，但主要用于中医辨证。气色形态手诊可以通过观察手的相关部位的气色、形态等变化判断身体健康情况并可进行西医诊断。当内脏发生疾病时，特别是在中枢神经产生敏化后，大量生理信号可以通过特殊传导通道传到手掌特定部位，引起局部皮肤组织炎性改变，进而引起局部颜色的改变。因此，本实验在前期工作的基础上[1]，通过急性肺损伤的实验研究，观察大鼠前爪特定区域的血含量是否也存在着特异性改变，通过通行的动物模拟实验研究肺的解剖器官与体表特定部位的对应关系，为气色形态手诊可以在临床诊断中通过人手部特定部位的气色形态诊断西医疾病提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
SPF级雄性SD大鼠20只，体质量(250±10)g，月龄3个月，由中国军事医学科学院提供，普通颗粒饲料，自来水，室温控制在15～24°C。实验动物批号：0018960。采用随机数字表法分为两组：模型组(10只)、对照组(10只)。
1.2 实验试剂与仪器
伊文思蓝(Evans blue，EB)为FLUKA，全部由上海化学试剂采购供应站进口分装，生产批号：82-11-02。实验用722型光栅分光光度计，为上海第三分析仪器厂生产。实验用丙酮是由天津化学试剂一厂提供的，批号：20080425。山东齐都药业有限公司生产的0.9%生理盐水，批号：1D07102005。
1.3 EB标准曲线的制作
根据参考文献[2-3]中的实验方法并对其进行疗改良，首先在7∶3丙酮生理盐水中加入EB，配制成系列浓度分别是(25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/mL)的实验用液体，然后使用722型分光光度机，仅在600 nm处测量吸光度(A)值，同时以浓度(C)为横坐标，A值为纵坐标，得回归直线方程：A = 0.028C + 0.027，r = 0.999 0，该值说明EB溶度与A值之间存在较好的线性关系。见图1。
1.4 肺损伤模型制作
对实验动物适应性饲养1周后，随机选对照组及模型组。仅对模型组大鼠禁食不禁水24 h，术前2 h禁水食。按参考文献[4-7]实验方法在腹腔注射内毒素(LPS)5 mL/kg，术后禁食，1 h禁水。
1.5 取材及处理方法
将两组大鼠从尾部静脉注射2.5% EB生理盐实验液，按照按0.2 mL/100 g的量注射[8]。成功注射25 min后用扭脱大椎的办法处死大鼠。尽快从前肢沿上肘处剪下前肢，放入2℃得冷藏柜内，约30 min后将实验材料取出，用小钉固定在白色泡沫板上，一起放置于-20℃冰箱中冷冻。依据大鼠前爪蹼的分布特点，参考气色形态手诊中内脏分布特点(肺区位于感情线以上向左右不超过无名指、小指内1/2的对应部位，图2)[9]，沿前爪蹼边界(图3)将大鼠手掌分为9个区域，每区分别取区域内肌腱以上的解剖组织，去掉毛，将其放入7∶3丙酮生理盐溶液中浸泡48 h，以1 500 r/min离心10 min，用722型分光光度机在600 nm处测量上清液中的A值[10-12]。
1.6 观察造模成败
肺组织病理学观察，看造模是否成功。对处死后大鼠的解剖肺进行观察，如大体形态等，再分别剪取损伤处组织(0.5 cm×0.2 cm)作为样本，以4%中性甲醛固定48 h，并对其进行常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、封片，在光学显微镜下观察肺组织病理学变化情况，为造模成功与否提供依据。
1.7 统计学方法
使用722型分光光度机，对在600 nm处测量浸泡液的A值进行测量，得到相关数据。采用统计学软件SPSS 11.5进行统计学分析，全部实验经过2次重复，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，进行t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺大体解剖及光镜检测
腹腔注射LPS 6 h后，肉眼观察肺表面呈暗红色，局部组织充血(图4)。光镜下，正常大鼠可以清楚观察到各级支气管、肺小叶及小叶间结缔组织肺组织，未见炎症细胞(图5A)。急性肺损伤大鼠肺间质水肿、增宽，大量炎症细胞浸润(图5B) ......
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