黄芪皂苷对神经胶质瘤的体外抑制作用及机制研究(1)
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[摘要] 目的 探讨黄芪皂苷体外抗神经胶质瘤活性及相关机制。 方法 采用体外培养的SHG44细胞株为研究对象，流式细胞仪检测黄芪皂苷作用后SHG44细胞凋亡率，免疫印迹法检测细胞凋亡关键蛋白p53、Bax、Bcl-2的表达变化。 结果 黄芪皂苷可诱导SHG44肿瘤细胞凋亡；黄芪皂苷可引发SHG44肿瘤细胞促凋亡蛋白p53、Bax高表达，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低。 结论 黄芪皂苷可通过p53信号通路激活和Bcl-2家族介导的细胞色素C途径诱导癌细胞凋亡，从而对神经胶质瘤细胞产生抑制作用。
[关键词] 黄芪皂苷；神经胶质瘤；p53；Bax；Bcl-2
[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)01(c)-0035-03
神经胶质瘤为神经系统中最多发的恶性肿瘤，且术后较易原位复发，目前各种预防和治疗药物疗效均不理想或毒副作用较大。黄芪、白术、防风是中医用于扶正的3种经典药材，其中皂苷类成分是重要的活性成分之一[1]。皂苷的抗肿瘤作用显著，作用机制复杂多样，目前已引起广泛关注，皂苷作为天然来源的肿瘤化疗药物具有重要的研究价值和广阔的开发前景[2-3]。本实验对黄芪皂苷的体外抑制神经胶质瘤细胞的效果进行了研究，并深入探讨了相关机制，为临床皂苷抗肿瘤研究奠定实验基础，以期为神经胶质瘤的防治开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
神经胶质瘤SHG44细胞株购自上海细胞研究所；黄芪皂苷购于中国药品生物制品检定所；胎牛血清、达尔伯克必需基本培养基(DMEM)购于Invitrogen公司，p53、Bcl-2、Bax和GAPDH一抗购自武汉博士德公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG二抗购自Promega公司，增强化学发光试剂盒(ECL)购于Millipore公司，PI染色试剂盒、Bradford法蛋白定量试剂盒购自北京中杉金桥公司。
1.2 药物处理
细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，4×104个/孔浓度接种于6孔板后继续培养24 h，之后吸弃培养液，用DMEM培养液将黄芪皂苷稀释配成0、2、4、8 μmol/L 的工作液，加入药物工作液后，细胞继续培养不同时间，进行后续实验。
1.3 SHG44细胞凋亡检测
SHG44细胞经上述各浓度黄芪皂苷工作液处理24、48及72 h后，经0.25%Trypsin-EDTA消化，200 g离心6 min，培养液弃去，PBS缓冲液洗3次，收集的细胞经70%的乙醇4℃固定2 h，14 000 g离心2 min，固定液弃去，PBS缓冲液(含5 mmol/L EDTA)500 μL进行细胞重悬，再经RNA酶室温孵育30 min，PI染液4℃避光条件下孵育30 min，筛网(400目)过滤除去未散开的细胞团块，流式细胞仪检测SHG 44细胞凋亡百分率。每组重复6次(n = 6)，结果取算数均数。
1.4 免疫印迹法检测p53、Bcl-2及Bax蛋白表达
分别用溶剂(对照组)和4 μmol/L黄芪皂苷(药物组)处理SHG44细胞，作用24、48及72 h后，免疫印迹法检测p53、Bcl-2及Bax蛋白表达水平，GAPDH作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：处理后细胞收集，4℃预冷PBS液洗3次，加入细胞匀浆液(50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L EDTA)，4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，吸取上清，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量为10 μL/well，之后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转到PVDF膜上，封闭，不同浓度稀释一抗p53(1∶500)或Bax(1∶500)或Bcl-2(1∶1 000)或GAPDH(1∶2 500)孵育，4℃过夜，HRP标记抗鼠(兔)IgG二抗常温孵育1 h，之后经ECL孵育，暗室内X线胶片成像，GelPro软件进行图像分析。每组重复6次(n = 6)，结果取算数均数。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两独立样本的计量资料采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 黄芪皂苷对SHG44细胞凋亡的影响
0 μmol/L 组(对照组)神经胶质瘤SHG44细胞凋亡率在观察期内始终处于本底水平(1.3%左右)，而浓度为2、4和8 μmol/L的黄芪皂苷作用24～72 h后，SHG44细胞凋亡率显著升高(P < 0.01)，药物作用浓度、作用时间与细胞凋亡率之间呈现明显的剂量-效应和时间-效应关系(表1)。
2.2 黄芪皂苷对SHG44细胞p53、Bcl-2及Bax蛋白表达的影响
为了深入探讨黄芪皂苷的诱导神经胶质瘤细胞凋亡的机制，笔者检测了不同凋亡信号通路p53、Bcl-2、Bax等关键蛋白的表达变化。黄芪皂苷作用24 h后，SHG44细胞内p53表达水平即显著升高，之后至72 h观察期内均显著高于对照组(P < 0 ......
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