甘草酸二铵对脂多糖诱导下人牙周膜成纤维细胞表达前列腺素E2的影响(1)
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[摘要] 目的 脂多糖(LPS)干预下，不同浓度甘草酸二铵(Diammonium glycyrrhizinate，DG)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)表达前列腺素E2(PGE2)的影响。 方法 取用组织块法原代培养的人牙周膜成纤维细胞，对细胞进行形态学及免疫学鉴别后，以浓度为10 mg/L的LPS进行诱导，用不同浓度的甘草酸二铵进行干预，采用免疫组织化学方法检测PGE2在HPDLFs中的表达变化。 结果 不同浓度甘草酸二铵能够下调同一浓度LPS诱导的HPDLFs表达的PGE2，随甘草酸二铵浓度的增加PGE2的表达量呈逐渐减弱趋势(P < 0.05)。 结论 甘草酸二铵可能对LPS诱导的HPDLFs致炎症过程中表达PGE2有重要的抑制作用，为临床牙周病治疗提供新的科研资料。
[关键词] 甘草酸二铵；脂多糖；人牙周膜成纤维细胞；前列腺素E2
[中图分类号] R781.4+2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)01(c)-0037-03
牙周炎主要是由革兰阴性菌引发的炎症反应，表现为牙周结缔组织的破坏。人牙周组织的主体细胞是人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPDLFs)、成骨细胞、破骨细胞等，其中人牙周膜成纤维细胞是牙周炎症引发的靶细胞。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作为革兰阴性菌细胞壁的关键成分，能够诱导人牙周膜成纤维细胞产生前列腺素E2、IL-1、IL-6、TNF-α等，对其有很显著的细胞毒性作用[1]。其中前列腺素E2(PGE2)是导致牙周破坏的重要刺激因子，它加速了破骨细胞的生成的同时抑制钙化，促进了骨吸收。
甘草酸二铵(Diammonium glycyrrhizinate)商品名为甘利欣，是中药甘草有效成分及其衍生物的第三代药品，在治疗病毒性肝炎方面取得了惊人的效果，同时它也被广泛应用于其他领域如抗炎、免疫调节、保护膜结构、解痉等。目前，其用于治疗口腔疾病方面的报道还比较少，本实验通过免疫组织化学方法观察不同浓度的甘草酸二铵对同一浓度LPS刺激HPDLFs表达PGE2变化情况的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
高糖型DMEM培养液(Gibco，美国)；胎牛血清、(四季青，北京)；1.25%胰蛋白酶(Sigma，美国)；抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体；SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒；LPS(Sigma，美国)；PGE2多克隆抗体(博奥森，兔抗人)；二抗(生物素抗小鼠)；甘草酸二铵(连云港正大天晴制药有限公司，批号：111230104)；25 mL无菌培养瓶、六孔板(Orange scientific)；CO2培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；GB-Ⅱ超净工作台、离心机、倒置显微镜(Olympus，日本)，DMSO(天津市标准科技有限公司)；BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)。
1.2 实验方法
①用组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞，传3代时运用免疫组织化学方法进行抗波形丝蛋白及角蛋白鉴定。②取鉴定后的的HPDLFs传至6代，以1.8×105/cm2左右的细胞质密度接种于置有盖玻片的六孔板，依次加入含有0.1、1、10、50、100 mg/L LPS的无血清培养基，以无血清的DMEM作正常对照组，孵育24 h后，运用免疫组织化学方法检测PGE2的表达变化，并筛选出PGE2表达最强时所需要的LPS的浓度[1]，用于后续实验。③在②中筛选出最佳浓度的LPS作为刺激因素，以1.8×105/cm2左右的细胞质密度接种于置有盖玻片的六孔板，依次加入含有0.1、1、10、50、100 mg/L的甘草酸二铵的无血清培养基，以最佳浓度LPS的无血清培养基作为阴性对照组，孵育24 h后，用免疫组织化学方法检测PGE2的表达变化情况。
1.3 免疫组化方法
将干预后的各组细胞爬片的盖玻片进行固定，用4%多聚甲醛作为固定液，采用即用型SABC免疫组化试剂盒，用3%双氧水灭活内源性酶，蒸馏水冲洗，室温滴加5%BSA封闭液孵育20 min，甩去多余液体不洗，然后滴加适当稀释的一抗(小鼠或兔 IgG)，4℃过夜后，滴加二抗(生物素抗小鼠)，DAB显色，苏木精复染，酒精脱水，用中性树胶封片，显微镜观察。
1.4 图像分析
将封好的免疫细胞化学标本应用BI-2000医学图像分析系统对结果进行图片的采集和分析。
1.5 统计学方法
应用SPSS 10.0软件处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较单因素方差分析，两两比较使用LSD-t法，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
原代培养细胞抗角蛋白抗体阴性；抗波丝蛋白抗体阳性，胞浆内棕黄染色，苏木素复染，胞核蓝染；说明是中胚层来源细胞，并且无混杂的上皮源性细胞 ......
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