尼美舒利对人宫颈癌Hela细胞株的抑制作用及其机制研究(1)
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[摘要] 目的 探讨尼美舒利体外抗宫颈癌的活性及相关机制。 方法 采用体外培养的Hela细胞株为研究对象，MTT法检测尼美舒利对Hela细胞的抑制率，倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变，Western blot检测细胞凋亡关键蛋白环氧化酶-2(COX-2)、Caspase-3的表达变化。 结果 尼美舒利可显著抑制Hela细胞增殖，形态学观察发现尼美舒利可诱导肿瘤细胞凋亡；尼美舒利还可抑制Hela肿瘤细胞COX-2表达，引发Caspase-3促凋亡蛋白Caspase-3高表达。 结论 尼美舒利具有明确的抑制宫颈癌细胞的作用，其机制之一可能是通过抑制COX-2引发肿瘤细胞的凋亡。
[关键词] 尼美舒利；宫颈癌；环氧化酶-2；Caspase-3
[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(a)-0004-04
近年来研究发现环氧化酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)与人类恶性肿瘤的发生密切相关，COX-2选择性抑制剂尼美舒利可对乳腺癌、胃癌、肝癌等发挥有效的抗肿瘤作用[1-7]。宫颈癌为女性最多发的恶性肿瘤之一，目前各种预防和治疗药物疗效均不理想或毒副作用较大。本研究对尼美舒利的体外抗肿瘤活性进行了研究，并深入探讨了相关机制，为其临床抗肿瘤研究提供实验依据，以期为宫颈癌的防治开辟新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株(Foucsbio公司)；尼美舒利半乳糖苷(中国药品生物制品检定所)；胎牛血清、DMEM培养基为Invitrogen公司产品；Caspase-3、COX-2和β-actin一抗购自Calcam公司；辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG购自Promega公司；Super Signal ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司；蛋白定量试剂盒(Bradford)、β-巯基乙醇、过硫酸氨等均购自上海生工公司。细胞培养皿和96孔培养板(Corning公司)；蛋白电泳及转膜装置(Bio-rad)；分光光度计(Beckman公司)；倒置显微镜(Olymmpus)，透射电子显微镜(PM-1200PX型)。
1.2 细胞培养
Hela细胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液，培养在37℃、5%CO2的细胞培养箱中。细胞每隔2 d以1∶3的比例传代1次。
1.3 尼美舒利对Hela细胞增殖抑制率检测
取对数生长期的Hela细胞，以4×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板，每孔100 μL，每组各设置6个复孔，培养24 h后吸弃原培养液，加入含不同浓度(0、100、200、400、800 μmol/L)尼美舒利200 μL。分别于24、48和72 h，向每孔中加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，小心吸弃全部上清液，然后向每孔中加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min至结晶全部溶解，于酶标仪上490 nm波长处测量吸光度(A)值。实验重复3次，按以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=×100%。
1.4 细胞形态学观察
1.4.1 倒置显微镜观察 对数生长期的人宫颈癌Hela细胞经0.1%胰蛋白酶溶液消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104个/mL，接种于24孔板，每孔1 mL。Hela细胞分为对照组0 μmol/L、200 μmol/L尼美舒利组和400 μmol/L尼美舒利组，按分组药物浓度加入尼美舒利。细胞继续培养48 h后，倒置显微镜观察。
1.4.2 透射电镜超微结构观察 Hela细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，4×104个/孔接种到6孔培养板中，37℃下5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h。待细胞完全贴壁后，吸弃培养液，分别换上含有0、200、400 μmol/L尼美舒利的培养基，培养48 h后，收集约107个细胞，以1 500 r/min离心10 min，形成细胞团。4℃下用2.5%戊二醛固定1 h，再用1%四氧化饿4℃下固定20 min。室温下丙酮脱水，再经浸透、包埋、修块、切片等程序制成50～70 nm超薄切片，铅染液电子染色后，JEM-1200EX型透射电镜下观察细胞超微结构。
1.5 免疫印迹法检测Caspase-3、COX-2蛋白表达
分别用溶剂(空白对照组)和400 μmol/L尼美舒利(尼美舒利组)处理Hela细胞 ......
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