蓝莓提取物对人结肠癌细胞的体外抑制作用及机制研究(1)
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[摘要] 目的 研究蓝莓提取物对人结肠癌细胞株HCT116增殖的体外抑制作用及其机制。 方法 应用不同浓度梯度蓝莓提取物处理人结肠癌HCT116细胞，噻唑蓝(MTT)比色法检测肿瘤细胞增殖情况，应用流式细胞术检测蓝莓提取物对HCT116细胞体外凋亡情况影响，并进一步研究了Caspase-3活性以及NF-κB表达变化情况以探讨相关机制。 结果 蓝莓提取物对HCT116细胞的增殖抑制作用呈现明显的剂量及时间效应关系；流式细胞仪检测显示各浓度(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)蓝莓提取物处理组HCT116细胞平均凋亡率分别为(8.86±1.03)%、(16.33±1.99)%、(49.29±6.73)%、(63.68±8.26)%，除0.25 mg/L组外，均显著高于对照组的(6.62±0.97)%；1.00 mg/L蓝莓提取物还可显著升高肿瘤细胞中Casepase-3活性，抑制NF-κB表达。 结论 蓝莓提取物可能通过激活Casepase-3级联反应通路和抑制NF-κB表达，诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡从而抑制其体外的生长与增殖。
[关键词] 蓝莓提取物；人结肠癌细胞；抑制作用；凋亡
[中图分类号] R735.3+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(a)-0014-03
人结肠癌是人类消化系统常见的恶性肿瘤之一，化疗是人结肠癌的主要治疗手段之一，但效果并不太理想，因此寻找有效的治疗或延长结肠癌患者生存时间的物质具有重要意义[1]。蓝莓为杜鹃花科，越橘属植物。研究表明，蓝莓除了含有丰富的维生素A和维生素C，还具有多种生物活性分子，具有抗氧化、抗溃疡和抗炎等功能，对癌症、糖尿病、神经退化和心脑血管等疾病均具有一定防治作用[2-4]，联合国粮农组织确定为人类健康食品。本实验以人结肠癌细胞株HCT116为研究对象，探讨蓝莓提取物对肿瘤细胞的生长抑制及诱导细胞凋亡作用，以期为消化道肿瘤的治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
蓝莓75%乙醇提取物购自大兴安岭林格贝有机食品公司。人结肠癌细胞株HCT116由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。DMEM培养基及胎牛血清为Invitrogen公司产品，NF-κB和GAPDH一抗购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG购自Promega公司，Super Signal ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司，Caspase-3活性检测试剂盒、PI试剂盒均购于江苏碧云天生物技术公司，蛋白定量试剂盒(Bradford)、β-巯基乙醇、过硫酸铵等均购自上海生工公司。细胞培养皿和96孔培养板购自Corning公司。蛋白电泳及转膜装置购自Bio-rad公司。分光光度计购自Beckman公司。流式细胞仪购自Becton Dickison公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 HCT116细胞用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液，培养在37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中。细胞每隔2 d以1∶3的比例传代1次。
1.2.2 癌细胞增殖抑制率检测 取处于对数生长期的HCT116细胞，调整细胞密度至2×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每个处理组各设置6个复孔。培养24 h，弃掉原培养液，换成含有不同浓度(0、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)蓝莓提取物的培养液，每孔200 μL。分别于24、48和72 h向每孔中加入20 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，小心吸弃全部上清液，然后向每孔中加入150 μL DMSO，震荡10 min至结晶全部溶解，于酶标仪上490 nm波长处读取吸光度(A)值。实验重复3次，按以下公式计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=×100%。
1.2.3 流式细胞法检测细胞凋亡 不同浓度蓝莓提取物作用24 h后收获细胞移入试管，PBS洗涤1次，400 μL Binding Buffer重悬细胞。取200 μL细胞悬液加入AnnexinV 5 μL，PI 10 μL，避光20 min，加入200 μL Binding Buffer上流式细胞仪检测。用Cellquest软件获取数据，用ModFit软件进行数据分析。
1.2.4 Caspase-3活性检测 分别用溶剂(空白对照组)和1.0 mg/L蓝莓提取物(药物组)处理HCT116细胞，作用后不同时间点(0、36、72 h)收集处理后细胞，加入50 μL 4℃ Lysis Buffer(含DTT 0.5 μL)，冰浴条件下裂解20～60 min，4℃离心(10 000 r/min)1 min ......
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