HPLC法测定不同产地硫熏和烘干金银花中绿原酸含量
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[摘要] 目的 比较不同产地硫熏和烘干金银花中绿原酸含量变化，考察硫熏对金银花内在化学成分的影响。 方法 采用HPLC法测定绿原酸的含量，C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.4%磷酸溶液-乙腈=87∶13，流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；检测波长为327 nm。 结果 绿原酸在0.083 6～0.418 0 μg范围内呈良好线性关系，r = 0.999 9，平均回收率99.30%(RSD=0.49%)。 结论 硫熏后金银花绿原酸含量明显增加，不同产地之间的含量差异也较大。
[关键词] 高效液相法；硫熏；烘干；金银花；绿原酸；含量测定
[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(c)-0098-02
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]，主要分布在山东、湖南、广东、河南、安徽、四川、陕西、贵州等地。味甘、性寒，为临床常用药，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、解热抗炎、利胆保肝等多种药理作用。临床用于痈肿疖疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病热等症。主要成分为绿原酸、木樨草苷、挥发油等。关于金银花的产地加工，多数本草著作均在采后阴干。现代研究报道有硫磺熏晒法[2]、蒸晒、烘干，强制通风装置干燥[3-4]，微波干燥等。目前，关于金银花硫磺熏蒸及烘干以后有效成分定量分析报道不多，本次试验测定了硫磺熏蒸和烘干后金银花中绿原酸的含量，为产地加工后金银花药材的质量评价提供参考依据。
1 仪器与试药
DIONEX Summit系统高效液相色谱仪，METTLER AE240十万分之一天平，FA2004A万分之一天平；所用乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯；绿原酸对照品(批号：110753-200212，中国药品生物制品检定所)；木犀草苷对照品(批号：111720-200603，中国药品生物制品检定所)；所用金银花药材由河南中医学院药学院董诚明教授鉴定为金银花(Lonicera japonica Thunb.)。烘干金银花采用40℃烘干5 h，再55℃，烘干10 h；硫磺熏蒸样品硫磺用量100 g/m3，熏蒸1次，熏蒸2 h，然后照上述方法烘干。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及系统适用性试验[5-8]
AichromBond-AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.4%磷酸溶液-乙腈=87∶13；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：327 nm；进样量10 μL；理论塔板数不低于1 000。
2.2 对照品溶液的制备
分别取绿原酸、木犀草苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，分别加50%的甲醇制成1 mL含40 μg的溶液，即得(10℃以下保存)。
2.3 供试品溶液的制备
取金银花粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%的甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理功率(250 W，频率35 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%的甲醇溶液至刻度，摇匀，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系的考察 精密量取“2.2”项下绿原酸对照品溶液2、4、6、8 mL，用50%的甲醇定容至10 mL，摇匀，得到5个浓度的绿原酸对照品溶液。按上述色谱条件各进样10 μL，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品的量(X)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程：Y=6.028 6X-5.211 9，r = 0.999 9，绿原酸在0.083 6～0.418 0 μg范围内呈良好线性关系。色谱见图1。
2.4.2 精密度试验 精密吸取同一绿原酸对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积，其RSD = 0.10%。提示仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验 取同一批金银花样品0.5 g共6份，精密称定，照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，测定绿原酸含量，其RSD值为1.34%。
2.4.4 稳定性试验 分别精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、10、12、24 h注入高效液相色谱仪，记录绿原酸峰面积，其RSD为0.87%，表明样品中绿原酸在24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的金银花样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入定量绿原酸对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果见表1。
2.4.6 样品含量测定 精密吸取各批次供试品溶液10 μL按“2.1”项下色谱条件进样，以外标法计算各样品溶液中的绿原酸的含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 关于硫磺熏蒸炮制方法的应用
硫磺熏蒸法作为一个传统的加工养护方法，一直在一些医院、生产企业和民间沿用。硫熏使中药材或中药饮片干燥快，不变质，不发霉，不虫蚀。该方法不仅改变药材外观，而且影响药材化学成分的变化，从而使药材的质量发生变化。在控制硫熏后二氧化硫残留量符合国家现行标准的情况下，该法作为新鲜金银花的加工方法有一定存在价值。
3.2 金银花不同炮制品中绿原酸的含量比较[9]
金银花含量测定结果可以看出，硫磺熏蒸后金银花中绿原酸的含量普遍比烘干品高，这可能是硫熏后金银花内部化学成分之间发生相互作用的结果，有待进一步研究。同一炮制方法中不同产地之间的差异较大，其中郑州产地金银花中绿原酸含量较低，封丘、山东两地含量较高，这可能与当地的土壤、气候等环境因素密切相关。各个产地金银花经两种方法炮制后，含量均在1.5%以上，符合《中国药典》2010年版规定。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：205.
[2] 杨俊杰，豆成林，李娟，等.河南金银花产地深加工的探讨[J] ......
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