重叠PCR克隆Exendin—4的基因及序列分析(2)
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参见附件。
2.3 Exendin-4的基因克隆测序结果
Exendin-4 cDNA 测序结果与数据库序列经Blast比较完全一致。见图3。
3 讨论
GLP-1不仅具有降糖作用，还可以减轻体重、改善血脂，达到直接或间接的心血管保护效应[6]，但GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ)降解，体内半衰期仅为2 min左右，很难应用于临床[7]。Exendin-4是从美国西南部大毒蜥唾液中分泌的天然肠促胰岛素拟似物，具有与GLP-1相似的促进胰岛素分泌功能，其生物活性比GLP-1高5000倍左右，且DPP-Ⅳ对Exendin-4酶解作用弱，因此，Exendin-4被认为是理想的治疗2型糖尿病的新型药物。人工合成的Exendin-4 (Exenatide，商品名为Byetta)是首个获准上市的肠促胰岛素拟似物[8-9]。然而，天然Exendin-4的提取成本高，难以满足临床应用需要。由于Exendin-4是一个只有39个氨基酸的短肽，体内半衰期短，稳定性差，因此，限制其在临床应用。用基因工程方法直接生产Exendin-4，表达水平低且容易降解，与载体蛋白融合表达也存在产量低、分离纯化困难等问题。为解决这一难题，本实验拟将Exendin-4 cDNA导入到分泌表达生物活性肽的专用载体，分泌表达目的蛋白Exendin-4，既可保证重组蛋白的活性又可避免原核表达高昂的生产成本。
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR ......
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