RNA干扰瞬时受体电位阳离子通道1表达抑制缺氧诱导的胶质瘤血管内皮生长因子上调的实验研究(2)
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1.5 钙图检测与分析
U87细胞接种于激光共聚焦培养皿，培养24 h后测定胞内钙离子浓度。细胞与10 μmol/L fluo-3/AM避光37℃孵育30 min后用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPEs)液漂洗3次。最后，加入含钙HEPEs液。实验步骤如下：首先加入100 μmol/L OAG，通过ASAS570激光共聚焦显微镜连续监测胞内钙浓度变化。待胞内钙浓度升高到一个稳定的平台时，加入2-APB，继续监测钙浓度的变化。激光共聚焦显微镜使用的激发光为488 nm，发射光为530 nm，扫描间隔1107 ms。实验共选择14个形态正常的细胞进行荧光监测，数据用ACAS570-IQ分析软件分析，并用Origin 7.0作图。
1.6 ELISA分析
缺氧24 h后，收集各组培养基上清。设定空白孔，分别取稀释的上清样品和标准品100 μL加入酶标板中，37℃孵育90 min；洗涤3次；每孔加入生物素标记人VEGF抗体100 μL，37℃孵育60 min；洗涤3次；除空白孔外，每孔加入亲和素-过氧化物酶复合物100 μL，37℃孵育30 min；洗涤4次；加入四甲基联苯胺(TMB)显色液100 μL，37℃反应15 min；加入终止液混匀后立即测量波长450 nm吸光度值。标准品数据用SPSS拟合浓度-吸光度值曲线回归方程，并据此计算各样品VEGF浓度。
1.7 RNA干扰实验
接种细胞于6孔板 ......
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